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细胞转染


转化、转染、转导、感染、接合的定义
接合(Conjugation): 原核生物中,细胞间通过纤毛接触彼此连接,这种细胞间的直接
接触,称为接合。细菌在接合的时候,两个细胞直接接触处形成接合管(conjugation tube),单链 DNA 可以直接通过这个通道转移,这个通道的形成需要有相应的基因表达, 如菌毛蛋白( pilin)基因形成性菌毛(sex pil

us)。一般情况下接合作用转移的基因是 带有接合必须基因的质粒(接合质粒,conjugative plasmid),但是少数情况下这种质粒 可整合到细菌染色体,就可能发生染色体转移 (这种含整合了接合质粒的染色体菌株被称 为高频重组菌株,high-frequency recombination, Hfr strains)。单链转移完毕,供体 和受体细胞分别合成互补链,完成接合。

转化(Transformation):原核生物中,裸 DNA 本身直接转移到遗传性状相异的原核生物
中而不通过其他媒介(如病毒)的过程。比如质粒转化,我们用的是纯化的质粒 DNA 本身, 没有任何媒介帮助。从这个概念的内涵来说,只要 DNA 进入细菌,就完成了转化过程,所 以这里不涉及转化的 DNA 是否复制和是否改变细菌的遗传性状以及蛋白是否表达等等。

转染(Transfection):真核生物中,转染就是原核生物中转化的同义词。之所以在真核
生物中使用转染这个词来代替转化,是因为人们之前已经习惯了用转化这个词表示真核细 胞变为恶性细胞。原核生物中,当细菌的转化过程中吸收的外源 DNA 是病毒 DNA 时就应该 称此过程转染。

转导(Transduction):在原核或真核生物中,通过病毒将一个宿主的 DNA 整合到另一个
宿主的细胞中而引起的基因重组现象。如果供体 DNA 未与受体 DNA 发生重组则称此转导过 程为流产转导。自然情况下,一些病毒与宿主 DNA 发生重组,形成新的病毒基因组,包装 以后感染其他细胞,就产生转导。实验研究中,常用基因重组的办法把目的 DNA 插入病毒 基因组,实现目的基因的转导。此外,这个 DNA 必须整合到新宿主细胞基因组才算实现转 导,否则称为转染。普遍转导( generalized transduction)通过完全缺陷噬菌体对供体 菌任何 DNA 小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象;局限转导 (restricted transduction )通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带 到受体菌中,并获得表达的转导现象。 感染(Infection)与转导:我们说的转导是指的目的基因(宿主 DNA)的转移过程,其主 体是目的基因,但是实现转导的手段是病毒感染,这里的主体是病毒载体。所以我们可以 这样说:通过逆转录病毒感染,把 ADA 基因转导到造血干细胞里面。但是我们不能这样说: 通过逆转录病毒转导,把 ADA 基因感染到造血干细胞里面。

细胞转染
稳定转染(stable transfection):稳定转染或持久的转染是用于建立克隆的细胞系,这
种细胞系中转染的目的基因整合到染色体 DNA 中并指导适量目的蛋白的合成。一般来说 (由细胞类型决定),形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染的效率低 1 到 2 个数量级。利 用可选择的遗传标记物有利于从非转染细胞的中分离出稀少的稳定转染物。

瞬时性转染(transient transfection):是将 DNA 导入真核细胞的方式之一。在瞬时
转染中,重组 DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的目 的基因不必整合到宿主染色体,可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞,并对溶解产 物中目的基因的表达进行检测。

原理和方法:细胞内吞、病毒感染、物理方法带入(显微注射、电穿孔、炮弹轰)

转染方法

原理

应用

特点 不适用于原代细 胞 操作简便但重复 性差 有些细胞不适用 相对简便、结果 可重复 但对细胞有一定 的毒副作用 转染时需除血清 适用性广但细胞 致死率高,DNA 和细胞用量大, 需根据不同细胞 类型优化电穿孔 实验条件 可用于难转染的 细胞、原代细 胞,体内细胞等 但携带基因不能 太大细胞需处分 裂期 需考虑安全因素 可用于难转染的 细胞 需考虑安全因素

代表转染试 剂

磷酸钙法

磷酸钙 DNA 复合物 吸附细胞膜被细胞 内吞 带正电的 DEAE-右 旋糖苷与核酸带负 电的磷酸骨架相互 作用形成的复合物 被细胞内吞 高脉冲电压破坏细 胞膜电位,DNA 通 过膜上形成的小孔 导入 通过侵染宿主细胞 将外源基因整合到 染色体中

稳定转染 瞬时转染

DEAE-右旋 糖苷法

瞬时转染

电穿孔法

稳定转染 瞬时转染 所有细胞

病毒介导 法

稳定转染

逆转录病 毒 通过侵染宿主细胞 将外源基因整合到 染色体中 带正电的脂质体与 核酸带负电的磷酸 基团形成复合物被 细胞内吞 将 DNA 用显微重金 属颗粒沉淀,再将 包被好的颗粒用弹 道装置投射入细 胞,DNA 在胞内逐 步释放,表达 用显微操作将 DNA 直接注入靶细胞核

特定宿主细 胞 瞬时转染 特定宿主细 胞

腺病毒

阳离子脂 质体法

稳定转染 瞬时转染 所有细胞

适用性广,转染 Lipo3000 效率高,重复性 好,但转染时需 除血清。转染效 果随细胞类型变 化大 可用于:人的表 皮细胞,纤维原 细胞,淋巴细胞 系以及原代细胞 转染细胞数有限 多用于工程改造 或转基因动物的 胚胎细胞

Biolistic 颗粒传递 法

瞬时转染

显微注射 法

稳定转染 瞬时转染

转染试剂
1. FuGENE? HD Transfection Reagent a.应用:瞬时转染、稳定转染,高效低毒 b.构成:80%乙醇+专用的混合脂质+其他专利配方(新型非脂质体转染试剂,化学合成物, 不含任何动物成分) c.存储:2- 8°C 玻璃瓶存储,不要置于 0 度以下,否则可能出现沉淀或其他影响。如出 现沉淀可加热到 37°C 后,在室温冷却。 d.工作:15-25°C ,4°C 取出后置于室温升温。转染试剂使用前混匀(vortex for one second or use inversion);FuGENE 与塑料中的残留化学药品接触可显著降低活性, 应尽量减少其与塑料的接触,避免用硅化管或吸管(在液面下加液,不要到底)。所有液体 现配现用。增加 DNA 的含量并不意味着更高的转染成功率。公司认为该试剂可全程使用, 但血清不影响血清依赖的细胞(如原代)转染效率。可以直接在原培养基上加入转染-DNA 混合液,无需更换培养基。 e.常用转染细胞:HeLa、NIH3T3、COS-1、-7、CHO-K1、Hep G2、HEK-293、MCF7、U2OS f.使用量:

转转染试剂-OM 血清:每 2μ g/100μ L,再加入一定比例的适量 FuGENE。 6 孔板,每孔加入总 DNA 量 2μ g;12 孔板,每孔加入总 DNA 量 1μ g;24 孔板,每孔加 入总 DNA 量 0.5μ g;96 孔板,每孔加入总 DNA 量 0.1μ g。公司建议贴壁细胞, FuGENE:DNA=3.5:1 或 2.5:1,96 孔板每孔 100ngDNA。

g.质粒 DNA 浓度和纯度的确定(southern blot, 琼脂糖凝胶电泳,可测 DNA 分子量):

分光光度法
原理:DNA 或 RNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在 260nm 处。 波长为 260nm 时,DNA 或 RNA 的光密度 OD260 不仅与总含量有关,也随构型而有差异。 纯 DNA(标准样品):OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有 RNA 污染;<1.6,表明有蛋白质、 酚等污染);纯 RNA:1.7< OD260/OD280 <2.0。对标准样品来说,浓度为 1μ g/mL dsDNA,OD260=0.02;浓度为 1μ g/mL ssDNA,OD260=0.027;浓度为 1μ g/mL

RNA,OD260=0.025;浓度为 1μ g/mL Olig,OD260=1/30。若样品不纯,则比值发生变化, 此时无法用分光光度计法对核酸进行定量,可用其他方法进行估算。 实验步骤: ? UV-240 紫外分光光度计开机预热 10min. ? 用重蒸水洗涤石英比色皿,吸水纸吸干,加入 TE 缓冲液后,放入样品室的 S 池架 上,关上盖板。 ? 设定狭缝后校零。 ? 将标准样品和待测样品适当稀释(DNA 5μ L 或 RNA 4μ L 用 TE 缓冲液稀释至 1000 μ L)后,记录编号和稀释度。 ? 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的 S 架上,关闭盖板。 ? 设定紫外光波长,分别测定 230nm、260nm、280nm 波长时的 OD 值。 ? 计算待测样品的浓度与纯度。 DNA 样品的浓度(μ g / μ L):OD260×稀释倍数×50/1000 RNA 样品的浓度(μ g / μ L):OD260×稀释倍数×40/1000

溴化乙锭法
溴化乙锭(EB)是一种嵌入型染料,其上的一个扁平的基团可插入到 DNA 或 RNA 链的 堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA 吸收 254nm 的紫 外辐射并传递能量给 EB,而 EB 本身在 302nm 和 366nm 处有光吸收。吸收的能量在 590nm 处释放,并表现为橙红色荧光。结合的 EB 的荧光产率远大于游离 EB 的荧光产率。EB 结合 量的多少与 DNA 的大小和构型有关,而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型 的同种 DNA 样品来说,溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的 DNA 含量成正比。 材料、试剂及器具: 1、标准 DNA 样品:已知浓度的线型 DNA,以 TE 稀释为梯度浓度的一系列标准样品。 2、质粒 DNA 的酶切样品(待测) 3、溴化乙锭(EB)5μ g / ml:以 PH8.0 的 TE 稀释 10mg/ml 母液而的。 4、紫外透射仪、黑色塑料板(或其他替代物) 实验步骤: ? 在黑色塑料板上点上两排溴化乙锭 2μ L 液滴,每排六点。 ? 取标准样品 2μ L 与第一排溴化乙锭混匀,则各点的 DNA 浓度分别为:20、15、10、 5、2、1(单位:ng/μ L)。 ? 取待测样品经过梯度稀释后,各加 2 μ L 于第二排的溴化乙锭上混匀梯度稀释 (单位:μ L) ? 把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上,关好样品室门,以短波紫外光激发荧 光,观察每一点的荧光强度或拍照。 ? 比较上下两排得亮度,确定待测样品的浓度。 注意事项: 1、标准样品含单一种类的 DNA,且大小与待测样品相近。 2、待测样品和标准样品使用同样的体积. 3、EB 具有中度毒性、强致癌性,操作时切记戴手套,切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、 口鼻等。 4、沾有 EB 的用具使用完毕统一集中于回收容器中,经净化处理后方可弃。 h:质粒制备 准备工作:灭菌的锥形瓶、10、200、1000ul 灭菌的枪头、抗生素、灭菌的 LB 培养基 实验步骤: ? LB 培养基的配置 ? 摇菌 (1)第一天下午 6:00 左右开始摇菌。从公司拿到的菌液一般为 200ul/管,取 50100ul,加入到 10ml LB 培养液中,37℃,240rmp/min,摇菌过夜(12-18h),切记要 加入相应的抗生素,抗生素浓度一般为 100ug/ml。

(2)第二天早上 8:00 停止摇菌,将菌液放入 4℃冰箱保存,下午 5:00 左右将其取出, 摇匀后准备第二次摇菌。取摇匀的菌液 5-10ml,加入 40mlLB 培养基开始摇菌至第三 天早上 8:00. ? 质粒提取(小抽) (1)将锥形瓶中的菌液摇匀后,视浓度而定取 1.5-5ml 菌液(一般情况下,取 2.5ml 即可)至灭菌的 1.5mlEP 管中,室温,10,000Xg 离心 1min(离心 2 次,第一次取 1ml 左右,离心后去上清,再加入 1ml 左右的菌液,再离心) (2)加入 250ul Solution I/RNase A(注意看有没有添加 RNA 酶抑制剂),彻底涡旋 混匀 (3)本步要逐个做,做完一个再做下一个:加入 250ul Solution II,上下颠倒轻轻 混匀(1min),孵育 2min,紧接着加入 350ul Solution III,立即颠倒混匀(2min), 直至出现白色沉淀。 (4)室温 15,000Xg 离心 10min (5)准备 HiBind Miniprep Column I(使用试剂盒配套的 EP 管),取上清(可以少吸 一点但禁止碰到白色沉淀),过柱,10,000Xg,室温离心 10min (6)倒掉 EP 管中的液体,向柱中加入 500ul Buffer HB 洗柱,10,000Xg,室温离心 10min (7)倒掉 EP 管中的液体,10,000Xg,室温离心 2min (8)向柱中加入 700ulDNA WASH BUFFER 洗柱,10,000Xg,室温离心 1min (9)空离心,室温 15,000Xg 离心 2min (10)更换新的 EP 管,向柱中加入 30-50ul EB Buffer,室温静止 2min,15,000Xg 离心 1min (11)测浓度 ? 菌种保存 灭菌的 50%甘油溶液:菌液=1:1(体积比),混合均匀后,-80℃保存。 2.Lipofectamine 3000 Reagent a.应用:瞬时转染、稳定转染、尤对于转染困难的真核细胞 b.构成:专利配方的脂质体 c.存储:4°C 玻璃瓶存储,不要置于 0 度以下。 d.工作: 4°C 取出后置于室温升温。转染试剂使用前混匀(vortex for one second or use inversion);Lip3000 与塑料中的残留化学药品接触可显著降低活性,应尽量减 少其与塑料的接触,避免用硅化管或吸管(在液面下加液,不要到底)。所有液体现配现 用。 e.使用量: 在任何一个新的转染开始前都应该分别实验推荐的两组不同浓度的 Lipo3000,以确认 其最佳浓度。 6 孔板,每孔加入总 DNA 量 2μ g;12 孔板,每孔加入总 DNA 量 1μ g;24 孔板,每孔加 入总 DNA 量 0.5μ g。 转染试剂-OM 血清 Component 96-well 24-well 12-well 6-well TM Opti-MEM Medium 5μ L 25μ L 50μ L 125μ L Lipo3000 0.1μ L 0.5μ L 1μ L 3μ L DNA-OM 血清 Component 96-well 24-well 12-well 6-well TM Opti-MEM Medium 5μ L 25μ L 50μ L 125μ L DNA(0.5-5μ g/μ L) 0.1μ g 0.5μ g 1μ g 2.5μ g TM P3000 Reagent 0.2μ L 1μ L 2μ L 5μ L MIX 转染试剂-OM 血清: DNA-OM 血清=1:1;余 OM 补齐
TM

Final volume 50μ L 250μ L 500μ L 1.5mL TM P3000 Reagent 加强 DNA 超螺旋,使其更易被转染。 TM 转入 siRNA(激发与之互补的目标 mRNA 的沉默) 稀释液不用加 P3000 Reagent,其他同上。

转染操作步骤(瞬转):
准备:转染试剂,质粒,OM 无血清培养基(Opti-MEM Reduced Serum Medium),灭菌 1.5mlEP 管,计时器,枪和普通灭菌枪头 ? 转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺孔板,使其在转染日密度为 70%。注:a. 2 各孔板、9cm 直径培养皿的表面积约等于 75cm 培养瓶表面积。用移液枪种满所有的孔 2 就类似于 3 个(75/25=3)25cm 的培养瓶。b.6 孔板每孔可加 1.8mL,12 孔板每孔可加 0.8ml,24 孔板每孔加 0.4mL,96 孔板每孔加 0.1mL,依次类推。以下举例各孔板稀释倍 数配液量计算。例:6 孔板的细胞是原培养瓶细胞稀释 4 倍的配液量,一瓶 1/4,孔板 相当于 3 个瓶,需要原细胞量 3/4。原细胞量 5mL,需要 5*3/4=3.75mL 原细胞量。总共 需加 1.8mL*6 孔 =10.8mL 。还需加入 10.8-3.75=7.05mL 的无双抗培养基,终止取 3.75mL 原细胞,7.5mL 无双抗培养基。实践中需多配点(6+1 原则) ,毕竟有损耗。 ? 将待转染的细胞 6 孔板从孵箱拿出,用酒精棉球擦拭,从瓶皿口擦起,再擦瓶皿身, 置于显微镜下观察细胞密度(用低倍镜) ,细胞状态(用高倍镜) 。 ? 细胞单层分布,密度达到 70%-90%(60-65%)即可用于转染处理,观察后用酒精棉球 擦拭,放入超净台,用移液器吸走各孔内旧培养液,加入各孔相应量的 OM 无双抗无血 清培养基。如死细胞较多,可以用 PBS 清洗一遍。若无意中加了含双抗的培养基,需 换液 PBS 清洗后至少等 1h,才可进行转染操作。 ? 配制各种转染混合试剂 MIX(OM+质粒+转染试剂) a.将转染试剂拿出恢复至室温 b.质粒瓶用酒精擦拭后放入超净台,勿擦除 marker 信息 c.1.5mlEP 管内配制转染试剂-OM 血清,轻弹混匀或枪轻吹混匀,在管盖上编号。 d. 1.5mlEP 管内配制 DNA-OM 血清,轻弹混匀或枪轻吹混匀,在管盖上编号。 e. 1.5mlEP 管内配制 MIX,转染试剂-OM 血清:DNA-OM 血清=1:1,轻弹混匀或枪轻吹混 匀(可用涡流混匀) ,在管盖上编号,开始计时 15min 静置 37°C 孵育(超过 30min 可 能导致转染效率降低) 。 ? 15min 反应结束后,用枪头吹散混匀,在待处理的 6 孔板上编号,写清楚处理信息。 开始计时,逐滴液面下加入不同的 MIX,各个角度和方向都应加到。MIX 反应总体时间 不超过 20min ? 转染试剂加完后,盖好 6 孔板的盖子,用酒精棉球擦拭板子,拿出超净台,前后左右 摇晃混匀,液体不要飞溅到盖子上,不能使液体打转。放入孵箱 1-2 天表达转染 DNA。
TM

转染操作步骤(稳转):
转染后 1-2 天(非选择性培养基)后,加入选择性培养基,维持 2-3 周,频繁更换培养基 以清除死细胞和细胞碎片,直到可见有稳定的细胞群附着,然后将细胞消化下来,继续置 于选择培养基中培养。选择培养基常加入 G-418(Geneticin,一种氨基糖苷类抗生素通过 过抑制转座子 Tn601,Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核、真核细胞 产生毒素。当 neo 基因被整合进真核细胞 DNA 后 ,则能启动 neo 基因编码的序列转录为 mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有 G418 的选择性培养基中生长)、Hygromycin B 类似表达潮霉素 B 磷酸转移酶。此外还应注 意加入抗生素的药物浓度,低浓度会导致耐药,产生耐药株,高浓度会导致即使转染成功 细胞也不足以抵抗抗生素毒性,故需构建药物浓度曲线,确定最佳药物浓度(5-7 天内, 未转染细胞>90%死亡)。

转染注意事项 有血清时的转染

血清一度曾被认为会降低转染效率,但只要在 DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清,在转 染过程中是可以使用血清的。转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液:在 DNA-阳离子脂 质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。在开始准备 DNA 和阳离子脂质体试剂稀释液 时要使用无血清的培养基,因为血清会影响复合物的形成。但在复合物形成后,在加入细胞中 前可以加入血清。阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同,因此如果你想在转 染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持 健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞,可以使用 OPTI-MEMⅠ培养基,一种营养丰富的无血清 培养基,或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞,建议使用 LIPOFECTAMINE 3000。

培养基中的抗生素
抗生素,比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无 毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活 性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺 板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培 养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是 GENETICIN 选择性抗生素的竞争性抑制剂。另 外,为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,仅使用比含血清培养基更少的抗生素量。

细胞维护和培养的演变
可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次,稀释程度使得下 次传代前细胞几乎融合。不要使细胞保持融合超过 24 小时。 大多数已建立的细胞系都是非整倍体,原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细 胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这 会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化,融化一管新鲜的细胞可能会 恢复原先的转染活性。比如,新鲜融化的 NIH 3T3 细胞比传代 8 次的细胞表现出更高的转染效 率(图 13)。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此,如果观察到转染效率降低, 可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。或者,几种来源于经筛选,转染效率较高细胞 亚系的细胞系现在有售。

细胞铺板密度
用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时,贴壁细胞密度为 70%6 6 90%,悬浮细胞密度为 2×10 -4×10 细胞/ml 时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止 期。因为转染效率对细胞密度很敏感,所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺 板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺 板密度最高的,CAT 活性也最高。得到最高活性所需的 LIPOFECTAMINE 试剂的量也相应增加 了。这些结果说明,对于转染相同量的 DNA 所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而 异。

启动子的选择
获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV 启动子在大多数 细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子,如 SV40 和 RSV(劳斯肉瘤病毒)相比,在 BHK-21 中其活性最高(图 15)。这三种病毒启动子在 T 细胞来源的细胞系,如 Jurkat 中组成 表达水平较低。转染后在培养基中加入 PHA-L 和 PMA 可以激活 Jurkat 细胞中 CMV 启动子,而单 PMA 就足以激活 KG1 和 K562(人骨髓瘤白细胞)中的 CMV 启动子。SV40 启动子的表达在含有大 T 抗原(存在于 COS-1 和 COS-7)时会提高,因为大 T 抗原可以刺激染色体外的合成。

DNA 量
高质量的 DNA 对于进行高效的转染至关重要。以前研究者使用 CsCl 梯度离心得到的 DNA 进行转 染,但是这种方法费时费力。其他的质粒纯化技术如 Marligen 的 High Purity Plasmid

Purification System 使用独特的阴离子交换树脂纯化 DNA,可以得到用于转染的高质量 DNA。 另外,Marligen 的纯化系统实验步骤很简单,可以在 2 小时内完成。

瞬时和稳定表达
DNA 转染后,转入基因的表达可以在 1-4 天内检测到。仅有一部分转入细胞的 DNA 被转运到细 胞核内进行转录并最终输出 mRNA 到细胞质进行蛋白合成。几天内,大部分外源 DNA 会被核酸酶 降解或随细胞分裂而稀释;一周后就检测不到其存在了。瞬时表达表达水平与位置无关,不会 受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少,但因为 DNA 摄入 效率和表达水平在不同实验中差异较大,实验必须很小心。为了进行稳定表达,转入的基因必 须能和细胞同步复制。包含整合 DNA 的细胞很少,必须通过对药物的抗性筛选进行扩增或通过 表型变化进行鉴定。稳定基因表达实验需要数周,如果需要验证蛋白产量,所需的时间更长。 但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。

瞬时转染和转染效率的监测
基因的瞬时表达在 24-72 小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监 测转染步骤的效率。可以使用报告基因来确定优化条件,其表达蛋白易检测,在目的细胞中不 含此蛋白或水平很低。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶(CAT),绿色荧光蛋白 (GFP),荧光素酶(Lux 或 Luc)以及 b- 半乳糖苷酶(b-gal)。可以使用简单的非同位素方 法检测 b-gal 的表达以测定转染效率和活性。pCMV?SPORT- bgal 质粒包含 CMV 启动子调控下的 LacZ 基因,转染入真核细胞内后可以直接表达 bgal。结合简单的检测步骤,可以做为监测转染 条件的一种方便灵敏的方法。

稳定转染细胞系的筛选
连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。氨 基糖苷磷酸转移酶基因(APH 或 neor)可以合成 APH 酶,通过磷酸化使药物失活,从而提供对 GENETCIN 选择性抗生素(G418 Sulfate)的抗性。抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质 粒上,也可以在不同的质粒上。如果两个不同的质粒同时转染,两个质粒都可能整合形成稳定 转化子。对于两种不同质粒的共转染,带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为 3:1 或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染 株的高效方法。瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。比如,使用 LIPOFECTAMINE PLUS 试剂得到的 NIH 3T3 细胞 GENETICIN 抗生素抗性克隆的数目比单独使用 LIPOFECTAMINE 增 加了大约 3 倍。要进行稳定的表达分析,在转染后次培养细胞,低密度铺板,给予生长空间, 在几天或数周内保持筛选压力。生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到 GENETICIN 抗生素的影 响。转染后,在开始筛选前等待 48-72 小时,使细胞表达足够量的抗性酶,保证在开始筛选时 可以自我保护。转染后 48-72 小时倒掉培养基,加入含有 GENETICIN 抗生素的培养基,抗生素 的浓度根据剂量反应曲线确定,足够杀死未转染细胞。因为许多因子影响到筛选所需的 GENETICIN 抗生素的最佳浓度,包括细胞类型,培养基和血清浓度等,所以有必要对每种细胞 作一个剂量反应曲线,确定最佳浓度。筛选最多可能需要一周时间,因为在致死剂量的 GENETICIN 抗生素存在条件下,细胞会分裂 1-2 次。在次培养细胞时使用较低剂量的抗生素, 一般是筛选剂量的一半。筛选后的细胞一般是离散的克隆,根据实验目的不同,可以分别纯化 (克隆),收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。

蛋白表达和培养基的选择
哺乳动物细胞系合成可溶的,翻译后修饰的蛋白,比细菌,真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有 可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白,而瞬时转染细胞可以快速表达, 迅速地合成小量蛋白。常用的细胞系包括 CHO,293 和 COS-7。Invitrogen 提供克隆的 293-F, 293-H,COS-7 和 CHO-S 细胞,来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。这些细胞也可用于无血 清和限定化学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。这些细 胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。用

于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。但更倾向于使用无血清培 养基表达蛋白,因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。无血清培养基一般针对某一特定细 胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添 加血清的培养基低得多)。无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化学成 分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一 种。在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基,无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。 在部分情况下(如 293-F,293-H,COS-7 和 CHO-S),对于已适应无血清或无蛋白培养基的细 胞,可以使用其培养基进行转染。其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成 分。在这些情况下,有必要在诸如 D-MEM 或 OPTI-MEMⅠ等培养基中进行培养和转染。


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