当前位置:首页 >> 建筑/土木 >>

siRNA 使用说明


siRNA 使用说明
产品简介: 产品简介:
常规化学合成 siRNA 为 21-25nt 的双链小分子 RNA。即用型的 siRNA,已经经过纯化、退火等处理,只要用灭菌的 ddH2O 或 RNase-free water 溶解并配制成 20?M 液体即可直接转染细胞。 产品剂型为冻干粉,产品剂量经过严格测算,以摩尔数标明。

保存和使用

: 保存和使用: 使用
保存:产品以冻干粉的形式,常温运输,常温下一两周内稳定。收到产品后,请于-20℃至-80℃保存。 液体剂型: siRNA 的贮存浓度一般为 20?M, 避免反复冻融(尽量不要超过 5 次), 应避免反复冻融 尽量不要超过 建议溶解后的产品分装保存 -20℃~ 分装保存, 避免反复冻融 分装保存 -80℃保存半年以上。如果近期不做实验,产品需长期放置,最好以冻干粉形式保存。 冻干粉剂型: -20℃~-80℃保存一年以上。开盖前,请先稍稍离心,将粉末收集于管底,再用灭菌的 ddH2O 或者 RNase-free water,配制成 20?M 的液体剂型。 表 1: 20?M 储存液的配置 产品含量(nmol) 溶解体积(?L) 0.5 25 1 50 2 100 5 250 10 500 20 1000

使用: 产品使用时,siRNA 最好冰上放置,使用完毕后,请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程,要求无 RNA 酶环 无 特别提示: 要求避光。 境,与产品接触的枪头、EP 管等都应该经过无酶处理;特别提示:荧光标记 siRNA 要求避光 特别提示

使用方法: 使用方法:
1. siRNA 的转染浓度:推荐的转染浓度是 50nM,可具体情况优化转染浓度,最佳转染浓度一般设置浓度梯度和时间曲线进 转染浓度: 浓度 行测试,建议优化的转染梯度为 100nM,50nM,20nM,10nM,5nM,1nM。 2. 使用 lipofectamine 2000(Invitrogen)转染 siRNA 的步骤 仅供参考 : 步骤(仅供参考 仅供参考): 转染 转染方法请参考转染试剂的使用说明,以下是使用 lipofectamine 2000(以下称 lipo2000)转染的参考方法。 (1) 转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,使转染时的细胞密度能够达到 30~50%(不同细胞生长速度不一样, % 因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),请使用无抗生素的培养基。 注意:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细胞活力,从而降低细胞的转染效率。而 细胞密度过低则可能达不到生长的要求,也会因此影响转染效率。 (2) 对于每个转染样品,按如下步骤准备 siRNA-lipo2000 混合液(试剂的用量和体积,请参照“转染 siRNA 用量参考”): a. 稀释转染试剂 lipo2000:使用前,将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀,然后取适量,用不含血清的优化培养基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)稀释,轻轻混和,室温孵育 5min; b. 稀释 siRNA:用 Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释 siRNA,轻轻混和; c. 稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后 与上述(b)稀释好的 siRNA 轻轻混和, 的孵育后, 室温培养 20min 以形成 siRNA-lipo2000 混和物,溶液可能会有浑浊,不过不会影响转染。 注意:稀释好的 lipo2000,如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低,应尽量在 30min 之内 之内与稀释好的 siRNA 混和。 尽量在 (3) 将 siRNA-lipo2000 混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中,轻轻摇晃,使之混和; (4) 将培养板置于 37 ℃的 CO2 培养箱中培养至检测时间(24~96h)。沉默效率的检测一般建议的时间为 24~72h。 可选操作(并非必要的操作 可选操作 并非必要的操作):转染操作完成,经过 37℃培养 4~6h 后,可以将孔里含有 siRNA-lipo2000 混合液的培养基移 并非必要的操作 去,更换新鲜的生长培养基,这样也不会影响转染的效率。注意:如果转染时使用的是不含血清的培养基(即血清饥饿的条 注意: 注意 件下进行转染),4~6h 后必须换成完全培养基(含血清、含抗生素),以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测:siRNA 的作用机理在于其引起靶 mRNA 的降解,因此 mRNA 的降解水平是 siRNA 沉默效率的最直 水平的检测: 接指标。一般在 siRNA 转染后 24~72h 即可以检测到靶 mRNA 水平的降低。检测方法一般采用 Real-time PCR 定量检测。 4. 蛋白水平的检测 蛋白水平的检测:蛋白水平的检测一般需要借助抗体(针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体)或报告基因系统检 测,检测手段一般有 Western-blot、免疫组化等。一般说来,检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因 素的影响,一般为 48~96h,甚至更长时间之后多点采样。

E-mail: support@ribobio.com

1

Tel: 020-32290221

www.sirna.cn

www.ribobio.com

实验指导
表1 使用 lipofectamine2000(invitrogen)转染 siRNA 用量参考(siRNA 转染浓度为 10-100nM) V1:细胞培养液体积;V2: siRNA-lipo2000 混合液总体积 每孔中总体积(v1+v2) 96-well 100?L(50?L+50?L) 100?L(50?L+50?L) 100?L(50?L+50?L) 100?L(50?L+50?L) 100?L(50?L+50?L) 24-well 500?L(400?L+100?L) 500?L(400?L+100?L) 500?L(400?L+100?L) 500?L(400?L+100?L) 500?L(400?L+100?L) 12-well 1mL(800?L+200?L) 1mL(800?L+200?L) 1mL(800?L+200?L) 1mL(800?L+200?L) 1mL(800?L+200?L) 6-well 2mL(1500?L+500?L) 2mL(1500?L+500?L) 2mL(1500?L+500?L) 2mL(1500?L+500?L) 2mL(1500?L+500?L) siRNA 的 终浓度 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM 100nM 50nM 30nM 20nM 10nM siRNA 的量/孔 0.5?L 0.25?L 0.15?L 0.1?L 0.05?L 2.5?L 1.25?L 0.75?L 0.5?L 0.25?L 5?L 2.5?L 1.5?L 1?L 0.5?L 10?L 5?L 3?L 2?L 1?L 如需共转染, 如需共转染 质粒 DNA 的量(ng) 10-100 10-100 10-100 10-100 10-100 100-200 100-200 100-200 100-200 100-200 200-400 200-400 200-400 200-400 200-400 500-1000 500-1000 500-1000 500-1000 500-1000 加入转染试剂的量/孔 (lipofectamine2000) 0.25?L(0.2-0.5?L) 0.25?L(0.2-0.5?L) 0.25?L(0.2-0.5?L) 0.25?L(0.2-0.5?L) 0.25?L(0.2-0.5?L) 1?L(0.5-1.5?L) 1?L(0.5-1.5?L) 1?L(0.5-1.5?L) 1?L(0.5-1.5?L) 1?L(0.5-1.5?L) 2?L(1.5-2.5?L) 2?L(1.5-2.5?L) 2?L(1.5-2.5?L) 2?L(1.5-2.5?L) 2?L(1.5-2.5?L) 5?L(2.5-6?L) 5?L(2.5-6?L) 5?L(2.5-6?L) 5?L(2.5-6?L) 5?L(2.5-6?L)

转染小贴示(以 孔板为例): 转染小贴示 以 24 孔板为例 :
a. 24 孔板每个孔的细胞培养总体积是 500?L。由于 siRNA-lipo2000 混合液的体积是 100?L,转染前可以先将原细胞培养 基(500?L)吸弃,更换为 400?L 无抗生素(可含血清)的新鲜培养基,使得培养基体积与 siRNA-lipo2000 混合液体积之 和刚好达到 500?L。转染时,各用 50?L Opti MEMⅠ来分别稀释 lipo2000 和 siRNA,对于 24 孔板,lipo2000 用量是 1?L/孔;siRNA 用量则根据所选用转染浓度而异(详见“转染 siRNA 用量参考 用量参考”)。 转染 b. 稀释 lipo2000 和 siRNA 操作要点: lipo2000 稀释后需要室温放置 5min,才能与稀释好的 siRNA 混合,因此,可以先稀释 lipo2000,在静置期间再稀释 siRNA。两者稀释完毕,轻轻混匀,注意在混合试剂时,请勿剧烈吹打或振荡,过度用力可能会破坏脂质体的结构, 以及 siRNA-lipo2000 混合物的形成。上述混合液至少需要放置 20min(室温),才能加到细胞培养板中,但是最长时间 不能超过 4-6h。lipo2000 用毕,请置于 4℃冰箱,小心保存。 c. 在某些情况下(如转染效率不佳),可以尝试在血清饥饿的状态下转染,也就是转染前将原培养基换成 400?L Opti-MEM I 稀释液(无血清无抗生素的培养基), 使得整个转染过程中, 细胞都是处于无血清状态, 注意这种情况下, 转染完 4~6h, 必须进行换液操作。 d. 转染完成后在 37℃的 CO2 培养箱培养 24~72h,直到可以检测为止。 e. 请选择合适的孔板(或者细胞培养板),以确保后续实验过程中有足够 RNA 或蛋白量用于沉默效果的检测。

E-mail: support@ribobio.com

1

Tel: 020-32290221

www.sirna.cn

www.ribobio.com

转染前后换液操作: 转染前后换液操作:
1) 转染前换液: 转染前换液: a. 如果细胞容易污染,在转染前一天铺板时,不能使用无抗生素的培养基,则在转染前务必要吸弃原培养基,更换成 无抗生素的新鲜培养基(可以含有血清)。 b. 换液量:如果是 24 孔板,无抗生素的新鲜培养基量是 400?L/孔,即吸弃培养板孔内原培养基 500?l,加入 400uL 无抗生素的新鲜培养基。为了保证细胞培养体积维持 500?L,无抗生素的新鲜培养基的量只需加入 400?L/孔,因为 转染时还要再加 100?l siRNA-lipo2000 混合液(V1=400?l, V2=100?l,V1、V2 见“转染 siRNA 用量参考”)。 2) 转染后换液 可选操作): 转染后换液(可选操作 : 可选操作 转染操作完成,经过 37℃培养 4~6h 后,可以将孔里含有混合液的培养基移去,更换新鲜的生长培养基,这样也不会影 响转染的效率。 注意:如果转染时使用的是不含血清的培养基(即血清饥饿的条件下进行转染),4~6h 后必须换成完全培养基(含血清、 含抗生素),以确保细胞生长。

注意事项及建议: 注意事项及建议:
实验要求无 RNA 酶环境,枪头、EP 管都要经 DEPC 处理; 整个实验过程,siRNA 应于冰上放置,使用完毕,请于-20℃或-70℃保存。 为了避免细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验的可靠性和重复性,一般建议: a. b. 每次转染实验时,每个转染样品至少设置3个复孔; 接种细胞时,保证每孔接种的细胞数量尽量相同,尽量使细胞在各孔的表面平均分布;对于siRNA的转染,各孔细胞 的密度均达到30~50%;对于siRNA与质粒DNA共转染,各孔细胞的密度均达到80~90%; c. 使用“转染siRNA用量参考”的推荐用量和体积,请小心取量,必要时进行相应的优化转染实验。

荧光标记 siRNA 使用说明
产品简介: 产品简介:
荧光标记的 siRNA 是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法。荧光标记的 siRNA 转染细胞后,可以直接使用用 荧光显微镜、 激光共聚焦显微镜观察, 也可以通过流式细胞仪检测, 确定是否有效转染及转染效率的高低。 荧光标记的 siRNA 还可用作追踪 siRNA 在胞内的定位及分布的情况。 表2 Dye FAM Cy3 Cy5 Max Excitation 492 555 649 锐博生物荧光标记 siRNA 种类 Max Emission 518 570 680 Compatible Filter 488±15 555±15, 488±15 647±15 GFP、CFP、FITC Compatible Fluorescence

由于 Cy5 的最大发射波长为 680nm,很难用裸眼观察,而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源,因此,使用普通 荧光显微镜时,不推荐使用 Cy5。通常观察 Cy5 时需使用激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。

使用方法: 使用方法:
1、保存: 、保存
-20℃~ -70℃,避光保存,冻干粉或液体。 液体(贮存浓度为 20?M)避免反复冻融(为保证 siRNA 的完整性,冻融次数最多不超过 5 次)。

2、转染(以 Cy3 标记的 siRNA 为例,仅供参考 : 、转染 以 为例,仅供参考): 2.1 使用 lipofectamin2000(Invitrogen)转染的步骤 以贴壁细胞为例 转染的步骤(以贴壁细胞为例 转染的步骤 以贴壁细胞为例)
Cy3-siRNA 的转染过程大体和普通 siRNA 是一样的,注意整个实验过程要尽量避光 尽量避光。 尽量避光 (1) 转染前一天, 接种适当数量的细胞至细胞培养板中, 使转染时的细胞密度能够达到 30~50%(不同细胞生长速度不一样, % 因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),请使用无抗生素的培养基。

E-mail: support@ribobio.com

1

Tel: 020-32290221

www.sirna.cn

www.ribobio.com

(2) 配制好 Cy3-siRNA 贮存液(20?M)后,按如下步骤准备 Cy3-siRNA-lipo2000 混合液(以 24 孔板的操作为例,其他孔板 各种的试剂用量,请参照“siRNA 使用说明”或“Lipofectamine2000 manual”): a. 取 1?l/孔 Lipo2000(使用前轻轻摇匀), 50?l Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释。 用 轻轻混和后在室温孵育 5 min; b. 取适量 Cy3-siRNA 贮存液(根据不同转染浓度取量,50nM 为 1.25?l/孔),用 50?l Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释,轻轻混和均匀; c. 稀释好的 Lipo2000(a)经过 5min 的孵育后,与稀释好的 Cy3-siRNA(b)轻轻混和,室温静置 20min,以形成 Cy3-siRNA 与 Lipo2000 混合物,如果溶液出现浑浊,属于正常现象,不会影响转染效果。 注意:稀释好的 Lipo2000(a)尽量在 30min 之内,与稀释好的 Cy3-siRNA(b)混和,如果放置时间过长,可能导致转染试剂 活性的降低; (3) 将 Cy3-siRNA-Lipo2000 混合液(c)加入含有细胞及培养液的孔中,轻轻摇晃孔板,使混和; (4) 在 37 ℃的 CO2 培养箱中培养至检测时间(参考的观察时间可以是转染后 12~24h); 可选操作:转染操作完成,经过 37℃培养 4~6h 后,可以将孔里含有 Cy3-siRNA-Lipo2000 混合液的培养基移去,更换新 鲜的生长培养基,这样也不会影响转染的效率。另外,更换培养基也可以将残留在培养液中的 Cy3-siRNA 移去。 (5) 转染效率检测:荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等(见后面)。

2.2 转染操作注意事项: 转染操作注意事项:
(1)避免 Cy3-siRNA 在紫外光、可见光下暴露,建议转染时室内和超净台内不要开灯(FAM 的避光要求尤其严格); (2)保持 Cy3-siRNA 管外有锡纸包裹; (3)转染操作请尽量快,操作时间尽量短,操作完毕后,请尽快将培养板放到培养箱。 (4)一般来说,使用 Lipo2000 作为转染试剂,转染后 4~6h 就可以保证 siRNA 转染过程完成。只要转染过程完成,就可以 进行转染效率的检测。参考的观察时间可以是转染后 12~24h。

3、观察与检测 、 3.1 检测方法:荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪 检测方法:荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、 3.2 荧光显微镜观察注意事项: 荧光显微镜观察注意事项:
(1)Cy3 是一种红色荧光染料,最佳激发波长 555nm,但在 488nm 处也能检测。 (2)使用 Lipo2000 转染, 参考的观察时间可以是转染后 12~24h, 我们建议尽量在转染后 24 小时内完成检测。 由于 Cy3-siRNA 相对比较稳定,对于检测的时间要求相对不是特别严格,成功转染的细胞如果没有受到强光刺激的话,荧光一般不会消失 (注:FAM 荧光很容易淬灭),在更长的时间也可以检测到荧光(如转染后 48h 还可以观察到清晰的荧光)。注意,检测前对 细胞进行的各种处理操作都必须避光。 (3)到了检测的时间,为减少背景干扰,也可以先用 PBS 或惯用的细胞洗涤液洗细胞 1~2 次,把没有转染进去而残留在培 养基或附在表面的 Cy3-siRNA 洗掉。注意洗涤时小心,不要使细胞也洗脱落了。 (4)确保熟悉荧光显微镜操作。建议检测时,可以先使光路先对准没有转染 Cy3-siRNA 的孔,调好焦距,打开激发光,一 切准备就绪后再进行观察(一般情况下可以马上看到荧光)。 (5)观察时间不宜过长,尽量避免荧光被猝灭,光路对准转染孔,马上观察和拍照。拍完荧光照片后,在同一视野中拍下明 场的细胞照片。 (6)初次操作,可能未必能成功,所以请妥善保存好未用完 Cy3-siRNA,-20℃避光 !熟悉操作后,重做一次,但注意如果 避光! 避光 重复次数太多,时间太久,荧光难免减弱! (7)请务必小心操作,耐心实验,每一个细节上的失误都有可能导致实验失败。 (8)检测的效果还与检测条件有关,包括检测时间、仪器的灵敏度等,不同操作者可能得到不一样的结果。 (如可以使用 Leica 莱卡显微镜观察,但是使用 Olmpus 奥林巴斯显微镜观察的效果可能不是很好) (10)注意保证 Cy3-siRNA 的保存和使用方法无误,另外,所有操作都必须在避光条件下进行。

3.3 流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测: 流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测:
请参照仪器说明书

E-mail: support@ribobio.com

1

Tel: 020-32290221


相关文章:
lipo2000转染操作步骤
Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以 24 孔板为例,其余规格的转染见表 1...lipo 2000说明书 4页 免费 lipo2000转染操作步骤 n... 2页 1下载券 Lipofe...
siRNA引物制备方法
The siRNA user guide (revised May 6, 2004) Selection of siRNA duplexes from the target mRNA sequence Using Drosophila melanogaster lysates (Tuschl et al....
jetPRIME 转染siRNA说明书
jetPRIME 转染siRNA说明书_生物学_自然科学_专业资料。JetPRIME 转染试剂转染 siRNA 简易说明书第 0 天:细胞接种 第一天:转染 在有血清存在的情况下转染, 使用 ...
lip2000转染说明书1
lip2000转染说明书1_生物学_自然科学_专业资料。lip2000转染说明书 ...2000 和 siRNA。 5) 可以使用荧光标记的 siRNA 帮助优化细胞系的转染条件*。...
METAFECTENE PRO中文说明书
METAFECTENE PRO中文说明书_计算机硬件及网络_IT/计算机_专业资料。METAFECTENE ...在 DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO 复合物形成过 程中严禁使用使用血清。 血清...
RFect小核酸转染试剂说明书
操作步骤:本说明书适用于 24 孔培养板的转染实验,其他规格的培养板的用量参照...l) 2 x 10 2 x 25 2 x 50 2 x 100 2 x 250 siRNA Amount (pmol)...
RNAi的作用机制及siRNA的合成方法
RNAi 的作用机制及 siRNA 的合成方法 RNAi 的作用机制及 siRNA 的合成方法 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是由双链 RNA(double strandedRNA, dsRNA)分子在 ...
用LIPO3000向细胞中转染siRNA
用LIPO3000 向 PK-15 细胞中转染 siRNA 以 24 孔板为例。 1 转染前一天...lipo2000转染操作步骤 2页 免费 lipofectamine3000 说明... 1页 1下载券 lipofe...
siRNA
SiRNA 使用说明 4页 1财富值 siRNA制备方法比较 6页 免费 最新siRNA研究进展 4页 2财富值 siRNA的转染 2页 2财富值 SiRNA讲稿 29页 1财富值 siRNA解答 6页...
转染中常见小问题及解决方法
siRNA 转染试剂和 LipoJet? DNA 转染试剂均配有特制的转染缓冲液。为了获得高效 率转染,请务必严格按照转试剂的操作步骤进行,在形成 DNA-转 染试剂或者 siRNA-...
更多相关标签: