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靶向HPV16


第 13 卷 第 5 期 2009 年 10 月

生命科学研究

Research 生 Life Science 学 研 究 命 科

Vol.13 No.5 Oct. 2009 年 2009

靶向 HPV16-E6 的 siRNA 对宫颈癌 CaSki 细胞的 抑制作用
刘立鹏1, 田

智1, 黄春霞1, 郭小芳1, 粟 敏1, 王晓春2*
(1. 长沙医学院,中国湖南 长沙 410219;2. 中南大学 湘雅医学院 医学检验系,中国湖南 长沙 410013 )



要: 以 RNA 干扰技术为手段, HPV 编 码 的 癌 蛋 白 E6 为 靶 标 , 探 讨 靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 对 宫 颈 癌 细

胞生物学行为 的 影 响 , 并 试 图 阐 明 该 实 验 的 临 床 意 义 . 构 建 靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 表 达 载 体 , 应 用 体 外 转 染试剂转染 HPV16-E6 阳性的宫颈癌 CaSki 细胞 . 以 RT-PCR 检测 CaSki 细胞中 E6 蛋 白 的 mRNA 的 表 达 , 借 助细胞色素 c 测定来分析细胞凋亡 相关分子的表达和活性, 从 而 研 究 靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 诱 导 细 胞 凋 亡 的 分 子 机 制 . RT-PCR 检 测 结 果 表 明 , 将 靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 的 表 达 载 体 瞬 时 转 染 到 HPV16-E6 阳 性 的

CaSki 细 胞 后 , 其 所 含 E6 蛋 白 质 和 mRNA 的 表 达 下 调 ; Western blotting 检 出 抑 凋 亡 蛋 白 Bcl-2 的 表 达 亦 告 下
调; 细胞色素 c 释放实验结果显示, HPV16-E6 siRNA 能够诱导细胞色素 c 从线粒体释 放到细胞浆中, 从而诱 导细胞凋亡 . 靶向 HPV16-E6 的 siRNA 能够有效抑制 细 胞 增 殖 并 诱 导 细 胞 凋 亡 . 靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 为 研 究 重 要 致 瘤 蛋 白 HPV16-E 的 功 能 开 辟 了 新 途 径 , 给 HPV16-E6 阳 性 肿 瘤 的 靶 向 基 因 治 疗 提 供 新 的 实 验 依 据, 并探索了 HPV 感染及宫颈癌的新基因疗法 . 关键词: RNA 干扰; 小分子干扰 RNA ; 人乳头瘤病毒; 基因治疗; 宫颈癌 中图分类号: R737.33 文献标识码: A 文章编号: 1007-7847 (2009 )05-0448-05

Depressant Effects of the HPV16-E6-Targeted siRNA on the CaSki Cell of Cervical Cancer
LIU Li-peng1,TIAN Zhi1,HUANG Chun-xia1,GUO Xiao-fang1,SU Min1, WANG Xiao-chun2*
(1. Changsha Medical College,Changsha 410219,Hunan,China; 2. Xiangya School of Medicine,Central South University, Changsha 410013,Hunan,China )

Abstract:To study the effects of the HPV16-E6-targeted siRNA on the biological behavior of cervical cancer cells by using RNA interference techniques and the HPV-encoded oncoprotein HPV16-E6 as a target. Moreover,we attempt to elucidate the clinical significance of its experiment. The expression vectors of HPV16-E6-targeted siRNA were constructed and transfected into the HPV16-E6-positive CaSki cells by in vitro transfection reagents. The expression levels of the HPV16-E6 mRNA and the mRNA encoded oncoproteins in cervical cancer CaSki cells were detected by RT-PCR and Western blotting,respectively. The expression and activities of the apoptosis-associated molecules were analyzed through cytochrome c assay in order to investigate the molecular mechanism of cell apoptosis induced by HPV16-E6-targeted siRNA. RT-PCR assay demonstrated that after the expression vectors of HPV16-E6-targeted siRNA were
收稿日期: 2008-12-18;修回日期: 2009-05-27 基金项目: 湖南省自然科学基金资助项目 (7JJ3058 )
* 作者简介: 刘立鹏 (1968- , ) 男, 河南西平人, 长沙医学院基础医学系副教授, 博士, 主要从事医学生物化学教学与研究; 通讯作者: 王晓

春 (1956- , ) 女, 湖南望城人,中南大学湘雅医学院医学检验系教授,博士,主要从事临床生化与分子诊断学研究, Tel: 0731-82650279, E-mail:wxclx@yahoo.com.cn.

第5期

刘立鹏等: 靶向 HPV16-E6 的 siRNA 对宫颈癌 CaSki 细胞的抑制作用

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transiently transfected into the HPV16-E6-positive CaSki cells,a variety of considerable changes occurred: the expression of E6 protein and mRNA in CaSki cells were down-regulated. Western blotting showed that the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was also down-regulated;the cytochrome c liberation test displayed its release from mitochondria into cytoplasm,thus inducing the cell apoptosis. HPV16-E6targeted siRNA can significantly inhibit the proliferation of transplanted tumor cells and induce cell apoptosis. It finds out a new approach for the functional study of this important oncoprotein HPV16-E and provides new experimental evidences for the gene-targeted treatment of HPV16-E6-positive tumors, especially exploring a new gene therapy for HPV infection and cervical cancer. Key words:RNAi;siRNA;human papilloma virus;gene therapy;cervical cancer (Life Science Research,2009,13 ) (5 :448~452 ) 宫颈癌 (cervical cancer 在女性生殖器肿瘤 ) 中占首要位置. 全世界每年估计有 50 万妇女诊 断为宫颈癌 [1]. 多年来,学者们一直致力于寻求 新的微创、副反应小、可以根治肿瘤的方法,并 尝试从基因水平对其进行治疗. RNA 干扰 (RNA interference,RNAi 技术的出现有可能为功能基 ) 因组学、 基因治疗学等众多领域带来新的突破[2,3]. RNAi 技术的发展将为人类研究基因功能、抗病 毒、治疗恶性肿瘤提供一种新的方法. 本实验应 用 RNA 干扰技术为手段,以 HPV 编码的癌蛋白 E6 为靶标,探讨靶向 HPV16-E6 的 siRNA 对宫 颈癌细胞的生物学行为的影响,从而为 HPV16E6 这一重要的致瘤蛋白的功能研究开辟了一个 新的途径,为 HPV16-E6 阳性肿瘤的靶向基因治 疗提供了新的理论和实验依据. ACA ACG G dtdt-3′ ,siRNA-4 正 义 链 5′ -GGU CGA UGU AUG UCU UGU U dtdt-3′,反义链 5′AAC AAG ACA UAC AUC GAC C dtdt-3′. 引 物 设 计 网 站 : www.genome.wi.mit.edu, Primer 5 软件设计引物,由上海博亚生物工程公 司合成、 纯化. 1.2 方法 1.2.1 感受态细菌的制备 用接种环在无菌超净工作台中 [4,5],从-70 ℃ 尚未溶解的细菌原种表面刮取少许,然后采用三 区划线法接种于无抗生素的 LB 固体培养基表 面,过夜培养,待细菌长到 1~2 mm 的菌落大小 时,挑取单个菌落,接种于 2~3 mL 的 LB 培养基 中,过夜 300 r / min 培养,取 1 mL 接种于 100 mL LB 中,300 r / min 摇菌,待细菌长到 0.2~0.4 OD 密度时,将培养物于冰上放置 10 min,然后 在 4 ℃离心,收 集的细菌用 10 mL 预 冷 的 0.1 mol / L CaCl2 致敏液悬浮细胞,置于冰上 10 min. 20 000 r / min 离心 15 min 收集细菌,按每 50 mL 的原培养物加入 2 mL 冰冷的 0.1 mol / L CaCl2 溶 液,悬浮细胞,4 ℃过夜,加入 10%灭菌甘油, 按每管 200 μL 分装,-70 ℃冻存. 1.2.2 质粒转化和抽提 将 构 建 好 的 质 粒 2 ng 加 入 预 冷 的 1.5 mL Eppendorf 管中,再加入 100 μL 感受态细胞,混 匀后置冰上 30 min;42 ℃,45 s,冰上 2 min,加 入 900 μL 不含氨苄青霉素的 LB 培基,37 ℃, 240 r / min 振摇 45~90 min. 取 100 μL 菌液铺平 皿,37 ℃培养过夜. 挑选单个克隆,小量抽提质 粒,酶切鉴定后,用 QIAGEN 质粒纯化药盒进行 质粒的大规模抽提,用于细胞转染. QIAGEN 质粒纯化药盒 tip 500 的步骤如下: 先用 3~5 mL 培养基 300 r/ min 振摇含质粒细菌过

1
1.1

材料与方法
材料

宫颈癌 CaSki 细胞 (由中南大学湘雅医学院 细胞中心惠赠) ,贴壁生长,含有整合的 HPV16 基因,约有 600 个拷贝. pSiRNA 表达质粒为表达 HPV16-E6 siRNA 的质粒及 pCON 阴性对照质粒,购自武汉晶赛生 物技术公司,所合成的 HPV16-E6 siRNA 基因序 列引自 GeneBank (NC001526 ,分别在不同区域 ) 选 取 了 4 个 干 扰 的 目 标 序 列 区 段 ,分 别 为 : siRNA-1 正 义 链 5′ -ACU GCG ACG UGA GGU AUA U dtdt-3′,反义链 5′-AUA UAC CUC ACG UCG CAG U dtdt-3′ ,siRNA-2 正 义 链 5′ -GUA UGG AAC AAC AUU AGA A dtdt-3′,反义链 5′UUC UAA UGU UGU UCC AUA C dtdt-3′ , siRNA-3 正 义 链 5′ -CCG UUG UGU GAU UUG UUA A dtdt-3′,反义链 5′-UUA ACA AAU CAC

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夜,再按 1 / 100 的量 1 mL 菌液接种于 100 mL LB细菌培养基中 12 h,然后 4 ℃离心沉淀收集细 菌,重悬于 9 mL QIAGEN 缓冲液 P1,加入 9 mL QIAGEN 缓冲液 P2,轻轻混匀,室温下 5 min, 再加入 9 mL 预冷的 QIAGEN 缓冲液 P3,混匀, 冰上 10 min,10 000 r / min 室温离心 15 min. 将 上 清 液 加 入 经 30 mL 缓 冲 液 QBT 平 衡 的 QIAGEN-tip,缓冲液 QC 洗柱,15 mL 缓冲液 QF 抽提 DNA,收集经重力作用滤下的液体. 0.7 倍 异丙醇沉淀 DNA,70%乙醇洗涤后,TE 溶解,用 紫外分光光度计测定质粒浓度待用. 1.2.3 Fugene 6 介导的瞬间转染 转染前一天将细胞种植于 6 孔细胞培养板

55 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,35 个 循 环 ,72 ℃ 10 min,取 10 μL 电泳、照相. 1.2.6 细胞色素 c 释放检测 应用 Fugene 6 为转染试剂在宫颈细胞中转 入 siRNA 质粒及其对照 [7],以未转染的细胞为对 照 ;转 染 后 分 别 于 24 h 后 收 获 细 胞 ,应 用 Cytochrome c apoptosis assay kit(BioVision )分别 提取胞浆和线粒体蛋白,应用 Western blot assay 检测胞浆和线粒体中 Cyt-c 的表达,胞浆中以 αtubulin 为蛋白量对照,线粒体中以 HSP60 为蛋 白对照.

2

结果

培养,待细胞生长至 50%~80%的融合度时弃培 基,用 PBS 洗一次;按照说明书操作用不含血清 培养基将 siRNA 质粒及其对照与 Fugene 6 配成 转染复合物,室温静置 15 min,立即加入细胞 中,5% CO2 培养箱 37 ℃培养 4 h 后,吸尽培养 基,再用 1 mL PBS 洗一次,加入新鲜血清完全 培养基,按所要求的时间培养后,收获细胞. 每 次实验设置未处理细胞对照. 1.2.4 用 TRIzol 试剂提取肿瘤细胞的 RNA 贴壁细胞在 100 mL 培养瓶中生 长融合 达 70%~90%时,用预冷的 PBS 液洗涤 3 次,加入 1.5 mL TRIzol,冰上放置 30 min,将瓶壁上的细 胞分装入两个 Eppendorf 管中, 加入 500 μL 氯仿, 上下颠倒数次混匀,12 000 r / min 离心 15 min,

2.1 HPV16-E6 siRNA 能 显 著 下 调 HPV16-E6 mRNA 水平的影响 将 HPV16-E6 siRNA 表达质粒及其对照转染 入 CaSki 细胞,24 h 后,提取总 RNA,应用 RTPCR 从 RNA 水平检测 HPV16-E6 的表达. 结果 显 示 HPV16-E6 siRNA 能 显 著 下 调 HPV16-E6 mRNA 水平 (图 1 . )
iR NA pS ON pC
E6 GAPDH

Arbitrary unit

取上清水相;重复 1 次;在所取水相中加入等体 积的异丙醇,颠倒数次混匀,置于-20 ℃ 1 h, 12 000 r / min 离心 15 min,用 70%乙醇洗涤沉 淀,室温放置 10 min,用 0.1%DEPC 处理水溶 解,-70 ℃保存备用. 1.2.5 逆转录 PCR(RT-PCR) 提取细胞中的总 RNA,按文献[6]的方法设 计 RT-PCR 体 系 ,逆 转 录 引 物 使 用 OligodT12-15. 用未转录的总 RNA 做对照和跨内含子设计引物 结合片段大小排除从基因组中的扩增. 提取细胞 的总 RNA,并用 DNaseⅠ处理消化基因组 DNA; 取 2 μg 处理后的 RNA, MMV 逆转录为 cDNA; 由 取 2 μL cDNA 进行 PCR 扩增. 应用 primer 3 设 计引物, GAPDH 基因上游引物: GACCACA 用 5′GTCCATGCCATCAC -3′,下游引物:5′- GTCCAC CACCCTGTTGCTGTA -3′,确定所提取总 RNA 的 质量,PCR 反应条件为 94 ℃ 2 min,94℃ 30 s,

2 1.5 1 0.5 0 CaSki pSiRNA pCON

图 1 HPV16-E6 siRNA 下 调 宫 颈 癌 CaSki 细 胞 中 HPV16-E6 RNA 的水平 Fig.1 The expression of E6 proteins and mRNA in CaSki cells were down-regulated by HPV16-E6-targeted

siRNA

HPV16-E6 siRNA 抑制 Bcl-2 的表达 在 证 实 活 性 HPV16-E6 siRNA 能 够 抑 制 HPV16-E6 的表达、 诱导细胞凋亡的基础上 [8],进 一步研究 HPV16-E6 siRNA 诱导细胞凋亡的分子 2.2 机 制 是 否 与 Bcl-2 的 表 达 相 关 . 应 用 Western

Ca Sk

i

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刘立鹏等: 靶向 HPV16-E6 的 siRNA 对宫颈癌 CaSki 细胞的抑制作用

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blotting 检测 HPV16-E6 siRNA 处理的 CaSki 细胞 中 Bcl-2 的表达,结果显示 HPV16-E6 siRNA 能 显著抑制 Bcl-2 的表达 (图 2 . )
CaSKi E6 pSiRNA pCON

3

讨论

子宫颈浸润癌 HPV16、18 (人乳头瘤病毒 16、18 亚型)检出率为 50 %~100 %,宫颈原位 癌中也有 87 %阳性率的报道,所以,HPV16、18 称为高危型 HPV[1]. RNAi 操作的简便性和对靶 基因表达抑制的高效性使其成为基因功能研究 的有力手段,并使系统性高通量功能基因筛选成 为可能. 目前公认的 RNAi 作用机制为 [9~12]:生 物体细胞内的双链 RNA 被 Dicer 识别并切割, 生成21~23 nt 的 siRNA. 高国兰等 [3]研究证实不 同序列的 E6、E7 siRNA,对靶基因的干扰效率 不同,以 E6-1 对 E6、E7-2 对 E7 表达水平的降 低作用最明显;E6、E7 siRNA 分别作用于宫颈 癌细胞,均引起了靶基因的特异、高效性的抑 制,并可至少维持到转染后 96 h. Choo 等 [4]将通 过复制缺陷型逆转录病毒介导的 HPV16-E7 反义 mRNA 转 导 宫 颈 癌 CaSki 细 胞 株 ,结 果 表 明 HPV16-E7 蛋白表达水平下降,CaSki 细胞增殖 速度降低,同时 Rb 蛋白表达水平升高,而 EF-1 和 bcl-2 蛋白表达水平降低. Cho 等 [8]以质粒作 为载体将 HPV-E6 反义核酸转染 HPV-E6 阳性的 CaSki 和 SiHa 细胞株,结果癌细胞的活性降低, 出现凋亡的形态学改变,同时 p53 蛋白表达水平 上调. 由于细胞凋亡是多因素、多通路参与的过 程[13,14],须进行多指标同时检测来判断凋亡;凋 亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同,而每个指 标维持有一个时间段,所以需要在不同的时间点 进行采样来判断凋亡. 目前检测细胞凋亡的方法 很多 [ 15],包括形态学检测、线粒体膜势能的检 测、细胞色素 c 释放实验、 Caspase 活性分析、 流 式细胞术 (flow cytometry 、DNA 片断化检测以及 ) 凋亡相关基因的表达检测等. 细胞凋亡是由于细 胞内外环境变化或死亡信号触发而导致在基因 调控下进行的细胞主动死亡过程. 引起细胞凋亡 通路主要有 3 条:死亡受体通路、线粒体通路以 及内质网通路. 我们前期应用流式细胞术检测 HPV16-E6 siRNA 对细胞周期行进的影响,结果 显示在 CaSki 细胞中靶向 HPV16-E6 的 siRNA 能 够显著抑制宫颈癌细胞周期行进,G0 / G1 期细胞 增加,而 S 期和 G2 / M 期细胞减少,表明 HPV16E6 siRNA 抑制 HPV16-E6 的表达,引起细胞周 期阻滞于 G0 / G1 期,进而抑制细胞增殖 [16]. 研究 显示,HPV16-E6 具有促进细胞增殖、调控细胞

Bcl-2

α-tubulin

1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 CaSKi

E6 Bcl-2

Arbitrary units

pSiRNA

pCON

图 2 HPV16-E6 siRNA 抑制 Bcl-2 的表达 Fig.2 The expression of Bcl-2 were depresssed by HPV16-E6-targeted siRNA

2.3

HPV16-E6 siRNA 诱导细胞色素 c 的释放

研究证实 HPV16-E6 siRNA 能够下调 Bcl-2 的表达,进一步检测 HPV16-E6 siRNA 是否诱导 细胞色素 c 的释放. 将 HPV16-E6 siRNA 表达质 粒及其对照转染入 CaSki 细胞,分别提取胞浆和 线粒体蛋白质,Western blot 检测细胞色素 c 的 表达. 结果表明,HPV16-E6 siRNA 能够诱导细 胞色素 c 自线粒体中释放入胞浆 (图 3 . )
Cytosol CaSki Cyto C pCON pSiRNA CaSki Mitochondrial pCON pSiRNA Cyto C Hsp60

α-tubulin

(A )
6 5 Cytosol cyt c Mitochondria cyt c

Arbitrary units

4 3 2 1 0 CaSki pCON

pSiRNA

(B )

图 3 HPV16-E6 siRNA 诱导细胞色素 c 的释放 Fig.3 HPV16-E6 siRNA can induce to release cytochrome c

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2009 年

凋 亡 等 重 要 生 物 学 功 能 ,我 们 在 证 实 了 靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 能够抑制 CaSki 细胞周期行 进,进而抑制细胞增殖的基础上,进一步研究靶 向 HPV16-E6 的 siRNA 对 CaSki 细 胞 凋 亡 的 影 响. 细胞色素 c 释放实验是检测早期细胞凋亡的 重要方法之一. 实验证实 HPV16-E6 siRNA 能够 下调 Bcl-2 的表达,并且能够诱导细胞色素 c 自 线粒体中释放入胞浆. 其诱导细胞凋亡的可能机 制为:靶向 HPV16-E6 的 siRNA 抑制 HPV16-E6 的表达后,使凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的表达下调, 并改变线粒体膜的通透性,诱导细胞色素 c 的释 放,介导细胞凋亡. 因此,可认为 HPV 编码的 癌蛋白 E6 可能为靶向基因治疗的潜在关键分子 靶标 [17]. 靶向 E6 的 siRNA 能够抑制细胞增殖诱 导细胞凋亡,从而为 HPV16-E6 这一重要的致瘤 蛋 白 的 功 能 研 究 开 辟 了 一 个 新 的 途 径 ,为 HPV16-E6 阳性肿瘤的靶向基因治疗提供了新的 实验依据.
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