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脂质体转染技术步骤


脂质体转染实验步骤 脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体 DOTMA 和 DOPE 的混合物(1:1).它适用 于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之一. 转染率高,优于磷酸钙法,比它高 5-100 倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞. 用 LR 进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批 LR 对转染某一特定 细胞适合的用量,作用时间等,对每批 LR 都要做.先要固定一个 DNA 的量和 DNA/LR 混合物与细胞相互作用的时间,DNA 可从 1-5ug 和孵育时间 6h,开始, 按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确 定出转染时间.因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24h 为宜. 细胞种类:COS-7,BHK,NIH-3T3,Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为 受体细胞. 1,操作步骤(方法一): 操作步骤(方法一): (1)细胞培养:取 6 孔培养板,向每孔中加入 2ml 含(1-2) x 10^5 个细胞 的培养基,37℃,18% CO2 培养基 40%-60%汇合时. (2)转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染 1 个空细胞所用的 量). A 液:用不含血清培养基稀释 DNA 使浓度为 1-10ug,终量 100ul. B 液:用不含血清培养基稀释 LR,使终浓度为 2-50ug,终量 100ul. 轻轻混合 A 液,B 液,室温中置 10-15min,稍后会出现微浊现象,但并 不妨碍转染. (3)转染准备:用 2ml 不含血清培养基漂洗 2 次,再加入 1ml 不含血清培养 基. (4)转染:把 A/B 复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置 37℃温箱中 6-24h, 吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养. (5)其余处理:如观察,筛选,检测等与其他转染法相同.

(6)注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响. 2,快速脂质体转染法操作步骤(方法二): 快速脂质体转染法操作步骤(方法二): 将细胞以 5 x 10^5 个/孔接种于 6 孔板中培养 24h,使其达到 50%-60% 板底面积. 在试管中配制 DNA-脂质体复合物. a,在 1ml 无血清 DMEM 中稀释 PSV1-neo 质粒 DNA 或供体 DNA. b,旋转 1s,再加入脂质体悬液,旋转. c,室温下放置 5-10min,使 DNA 结合在脂质体上. 弃去细胞中的旧液,用 1ml 无血清 DMEM 洗细胞 1 次后弃去,向每孔 中直接加入 1mlDNA-脂质体复合物,37℃培养 3-5 天. 再于每孔中加入含 20%胎牛血清的 DMEM,继续培养 14-24h. 吸出 DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含 10%胎牛血清的 DMEM,2ml/ 孔,再培养 24-48h. 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定. 3,稳定的脂质体转染法: 稳定的脂质体转染法: 接种细胞同前述,细胞长至 50%板底面积可用于转染. DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前. 在每孔中加入 1ml 含 20%胎牛血清的 DMEM,37℃培养 48h. 吸出 DMEM,用 G418 选择性培养基稀释细胞,使细胞生长一定时间, 筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行.

细胞转染技术总述
一,细胞转染途径 转染大致可分为物理介导,化学介导和生物介导三类途径.电穿孔法,显微 注射和基因枪属于物理介导技术; 化学介导方法很多, 如经典的磷酸钙共沉淀法, 脂质体 转染方法,和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始 的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术. 1, (1) 物理介导 电穿孔法:靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞. 优点:转染效率较高 缺点:需要昂贵的仪器(电穿孔仪);对细胞的损伤较大,每次转染需要 更多的细胞和 DNA;每种细胞电转的条件都需要进行多次优化. (2)显微注射:借助显微注射器直接把 DNA 注入核内,使之整合入受体细胞基 因组中. 优点:转染效率高,可用于瞬时转染和稳定转染 缺点:导入 DNA 时需要一个细胞一个细胞注射,不适合大量转染 (3)基因枪:依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内. 2, 化学介导 (1)磷酸钙共沉淀法: 磷酸钙有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面结合,氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按 一定的比例混和,形成极小的磷酸钙-DNA 复合物沉淀黏附在细胞膜表面,借助 内吞作用进入细胞质.沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要. 优点:能用于任何 DNA 导入哺乳类动物,瞬时转染和稳定转染.

缺点:转染效率低:进入细胞的 DNA 只有1%-5%可以进入细胞核,其中 只有不到1%的 DNA 可以与细胞 DNA 整合, 在细胞中进行稳定表达. 重复性不佳: pH 值,钙离子浓度,DNA 浓度,沉淀反应时间,细胞孵育时间乃至各组分加入顺 序和混合的方式都可能对结果产生影响. (2) 脂质体转染法:

中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA,借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内.带正 电的阳离子脂质体,DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电 的 DNA 自动 结合到带正电的脂质体上,形成 DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电 的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞. 优点:适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞,可用于瞬时转染和稳定 转染;转染效率高,比磷酸钙法高 5-100 倍;能够把DNA和RNA转染到各种 细胞, 转染的稳定性好, 可重复性高, 转染时最好不加血清和抗生素. #1048715; 缺点: 阳离子脂质体细胞毒性相对较高, 对部分细胞可能会干扰细胞的代谢. (3) 多种阳离子物质介导:

DEAE-葡聚糖介导的转染, 其原理还不清楚, 可能是通过内吞噬作用而使 DNA 转导进入细胞核,此法只适合暂时转染实验,转染效率与 DEAE-葡聚糖浓度以及 细胞与 DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系,可采用较高浓度的 DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间 (30 分钟-1.5 小时), 也可用较低浓度(250g/L) 的 DEAE-葡聚糖作用较长时间(8 小时). 3,生物介导 病毒介导的转染:以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源 DNA 导入到 细胞中, 其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用. 优点:整和效率高, 可使外源基因在宿主细胞中长期表达,适用于难以转染 的原代细胞.

缺点:存在潜在的安全危险性. 二,理想的细胞转染方法 理想细胞转染方法,应该具有转染效率高,细胞毒性小,重复性好,安全, 简单等优点.病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞 毒性很低的优势.但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强 的选择性,在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导的转染方法,则各有 其特点.

三,细胞转染分类 瞬时转染:是指外源基因进入受体细胞后,存在于游离的载体上,不整合到细胞 的染色体上. 稳定转染: DNA 整合到宿主细胞的染色体中. 四,报告基因 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因, 是一个其表达产物非常容易被鉴 定的基因.把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它 目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目 的基因的表达调控. 常用的报告基因系统:半乳糖苷酶报告系统,荧光素酶报告系统,荧光蛋白 报告系统(GFP)等. 五,转染方法 本人用的是 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 在 24 孔板转染单层贴壁细 胞.(别的方法可以参考生产商提供的 protocol)

1,转染前 1 天将 0.5~2×105 细胞接种于 24 孔培养板,并加入 500ul 不含抗生 素的完全培养基,以保证转染时细胞汇合达 90~95%. 2,准备复合物 (1) 将 0.8ug DNA 稀释于 50ul 无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀. (2) 将 2ul Lipofectamine2000 稀释于 50ul 无血清无抗生素的培养液中, 轻轻浑匀,室温孵育 5 分.注意:必须在 25 分内进行. (3) 5 分后将它们混合,并轻轻浑匀,室温孵育 20 分. 3,吸去培养板的培养基,用 PBS 或无血清培养基(最好)清洗细胞 2 次. 4,将复合物(总体积 100ul)加入培养孔,前后摇动培养板使其分布均匀. 5,将细胞放入培养箱孵育 4~6h 后,可以更换含血清培养液去除复合物(也可 不用). 6,24~48h 后可以观察转入基因表达情况. 7,稳定转染:换含血清培养基 24h 后将细胞以 1:10(或更高比例)传代,1 天后更换筛选培养基筛选. 8,优化:要保证细胞汇合率达 90~95%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000 比率 1:0.5~1:5,一般细胞 1:2~3.

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