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茶渣资源的开发与利用


第 11 卷 第 5 期 2 0 1 1 年 8 月

中 国 食 品 学 报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology

Vol. 11 No. 5 Aug. 2 0 1 1

茶渣资源的开发与利用—— —茶叶蛋白肽的功能性研究

r />靳伟刚 1 张 洋
1

罗鋆琳 1




2

1

林同宝 1

饶平凡 2

叶秀云 1,2*
福州 350002 )

(1 福建福大百特科技有限公司 摘要

福州 350002

福州大学生物科学与工程学院

对茶渣中茶叶蛋白的酶水解产物—— —茶叶蛋白肽的功能性进行研究。 实验结果表明,茶叶蛋白肽具有很

强的抗氧化活性,且在较低浓度下就可起作用 ;其 对 羟 自 由 基 、超 氧 阴 离 子 自 由 基 和 DPPH 自 由 基 的 清 除 率 最 高可分别达到 99% 、100% 和 97% ,且均显著高于维生素 C 。 茶叶蛋白肽对亚硝酸根离子也有很强的清除效果,

IC50 为 0.2 mg/mL ,清除率最高可达 100% 。 茶叶蛋白肽还具有很好的抗凝血作用,当其质量浓度为 3 mg/mL 时,
抗凝血作用明显优于抗凝剂柠檬酸钠。 当茶叶蛋白肽的剂量为 0.75 g/kg 时,可显著增强机体的非特异性免疫功能。 关键词 文章编号 茶渣; 茶叶蛋白; 酶法水解; 茶叶蛋白肽; 生物活性; 功能性

1009-7848 (2011 )05-0052-07

茶叶中蛋白质含量约占茶叶干物质总量的

团进行交联而凝聚,所以茶叶蛋白有很强的抗性, 难溶解,使之应用起来较困难。 本文对酶法水解产 生的茶叶蛋白肽的功能性进行研究。

15%~30% , 其中绝大多数是非水溶性蛋白质,只 有 1%~2% 的蛋白质为水溶性蛋白质。 速溶茶加工 与茶叶沏泡,只能利用大约 1% 的茶叶蛋白,主要
为清蛋白。 因此人们每天通过饮茶摄取的茶叶蛋 白质不超过 70 mg,大量的茶叶蛋白连同茶渣一起 被丢弃,造成很大的浪费。 茶叶蛋白还具有保健功能。 1994 年长海医院 营养科蔡东联教授对动物和人体做了大量的实 验, 实验证明茶叶蛋白和茶多酚一样具有一定的 保健功能 [1]。 同年 Bu-Abbas A 等 [2] 在进行茶叶蛋 白抗突变的研究中发现, 茶叶蛋白对接受放射治 疗引起的致突变效应有保护作用。 2001 年第二军 医大学长海医院的李燕等 [3] 在用小鼠进行茶叶蛋 白预防辐射的研究时发现, 茶叶蛋白具有清除超 氧阴离子功能, 可抵抗电离辐射所引起的致突变 效应。 2005 年活泼等人 研究发现非水溶性茶叶
[4]

1
1.1

材料与方法
材料

1 ) 乌龙茶茶渣:由福建漳洲大闽食品有限公
司提供,常温阴凉干燥处保存。

2 ) 复合酶 A 和复合酶 B 均由福建福大百特 科技发展有限公司提供。复合酶 A 的组成:角蛋白
酶 70% ,木瓜蛋白酶 10% ,胰蛋白酶 10% ,碱性蛋 白酶 8% ,菠萝蛋白酶 2% 。 复合酶 B 的组成:木聚 糖酶 30% ,葡聚糖酶 30% ,α- 淀粉酶 20% ,果胶酶

15% ,纤维素酶 0.5% ,酸性蛋白酶 0.02% 。 3) 胃 蛋 白 酶 (1∶3 000)和 胰 蛋 白 酶 (1∶250):
购于上海生工,冰箱冻存。

4) 昆明小鼠:18~22g,普通级,购于福建省福
州市福建医科大学。

蛋白具有明显的降血脂效果, 对动脉粥样硬化及 冠心病有一定的预防作用。 由于茶叶蛋白中 80% 以上为相对分子质量很 大的谷蛋白, 谷蛋白分子间通过二硫键和疏水基

5) 其余试剂均为国产分析纯试剂。 1.2
主要设备

BS-124S 型电子天平, 德国赛多利斯; 1200
型液相色谱仪,美国安捷伦公司;K9860 型全自动 凯氏定氮仪, 济南海能公司;WFZ UV-2000 型紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 ,尤 尼 柯 (上 海 )仪 器 有 限 公 司;PD-10 型 pH 计,德国赛多利斯;Seastar R20L 旋转蒸发仪, 无锡市星海王生化设备有限公司;

收稿日期: 2010-08-26 基金项目: 福建省区域重大项目(2009Y3001 ) 作者简介: 靳伟刚,男,1981 年出生,工程师 通讯作者: 叶秀云

第 11 卷 第 5 期

茶渣资源的开发与利用—— —茶叶蛋白肽的功能性研究

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3740 型高速离心机, 日本 Kubota 公司;FreeZone 18L 冷冻干燥机,美国 Labconco 公司。 1.3 检测方法 1.3.1 茶 叶 蛋 白 酶 解 产 物 相 对 分 子 质 量 分 布 检
—高效凝胶过滤色谱法 测—— 取适量茶叶蛋白酶 解液, 于 4 ℃ 10 000 r/min 离心 10 min , 经 0.22

仪浓缩 5 倍后,冷冻干燥得茶叶蛋白肽粉。

1.4.3

茶叶蛋白肽的体外消化

取 10.0 g 茶叶蛋

白 肽 于 500 mL 三 角 瓶 中 , 用 稀 盐 酸 调 节 pH 至

1.5,按 2 000 U/g 茶叶蛋白肽加入胃蛋白酶,37 ℃ 水浴 3 h。 反应终止后取 1mL 反应液,10 000 r/min 离心 5 min ,收集上清液进行分析。 其余反应液用 5 mol/L NaOH 调节 pH 至 8.0, 按 2 000 U/g 茶叶 蛋白肽加入胰蛋白酶,37 ℃水浴 3 h。 反应终止后 取 1mL 反应液,10 000 r/min 离心 5 min ,收集上清
液进行分析。

μm 微 孔 滤 膜 过 滤 后 , 取 10 μL 直 接 上 样 Toyopearl HW-40s 色谱柱, 以含 0.15 mol/L NaCl 的 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)为洗脱液,流速 0.4 mL/min ,检测波长 215 nm。 根据标准色谱图,
确定样品中各组分的相对分子质量范围。

1.3.2 体外抗氧化活性测定 羟自由基体系采用 Fenton 反应体系模型 [5-6],超氧阴离子自由基体系
采 用 邻 苯 三 酚 法 [7],DPPH 自 由 基 体 系 采 用 DPPH 法[8],亚硝酸根离子体系采用对氨基苯磺酸法 [9]。

2
2.1

结果与讨论
茶叶蛋白肽的自由基清除活性 在生物体内, 自由基增加对生物大分子和膜

结构均有不同程度的损伤作用, 破坏了相关细胞 结构与功能,导致疾病发生。 因此向体内补充抗氧 化剂,清除过多的自由基或中止体内自由基反应, 可防止线粒体肿胀,抑制膜的脂质过氧化反应,蛋 白质交联,多糖降解等,保护生物膜结构和功能的 完整, 从而达到抵抗疾病的目的, 维持机体的健 康[14]。 目前在食品、 药品及保健品中使用的抗氧化 剂大多为化学合成的, 长期使用易造成人体内的 残留, 因此开发利用植物来源的天然抗氧化剂具 有重要的意义。 酶法水解天然茶叶蛋白所得茶叶 蛋白肽, 消除了大分子茶叶蛋白不利于与自由基 产生作用的高度紧密结构, 且在安全性上具有很 大的优势。 按照本文 1.4.1 节和 1.4.2 节所述方法, 以干 茶渣粉为原料,制备一定量的茶叶蛋白肽粉,然后 分析不同浓度的茶叶蛋白肽 (用相应的缓冲液溶 解 )对 羟 自 由 基 、超 氧 阴 离 子 自 由 基 、DPPH 自 由 基和亚硝酸根离子的清除作用, 并与相同浓度的

1.3.3

[10-12]

抗凝血活性测定 进行评定。

通过测定全血复钙时 对影

1.3.4

茶叶蛋白肽对小鼠免疫功能的影响

响非特异性免疫功能的指标进行研究, 以确定茶 叶蛋白肽对小鼠免疫功能的影响。 所用方法为免 —小鼠碳廓清指 疫器官重量法和单核吞噬细胞—— 数法 [13]。

1.4 实验流程 1.4.1 茶渣中茶叶蛋白的制备 称取 1.0 kg 茶渣 于 50 L 配料槽中,加入 30 L 水,混合均匀后于室
温浸泡 30 min ;将混合液用胶体磨磨碎成乳状液, 再将乳状液倒入 50 L 反应罐中, 加入 5 g 复合酶

B,混合均匀后, 50 ℃ 保温反应 2 h;加 入 600 mL 5 mol/L 氢氧化钠溶液, 使其最终浓度为 0.1 mol/ L,充分混合后,90 ℃保温反应 2 h;冷却,使反应液
的温度迅速降至 15 ℃ ,然后静置沉降 1.5 h;移取 上清液,用 5 mol/L 稀盐酸调节 pH 至 3.5,15 ℃ 静 置 1 h;离 心 ,收 集 蛋 白 沉 淀 ,用 纯 水 将 其 洗 至 中 性,然后干燥得茶叶蛋白粉。

1.4.2

茶叶蛋白肽的制备

称 取 300.0 g 茶 叶 蛋

VC 进行比较, 考察茶叶蛋白肽的体外抗氧化活 性,结果见图 ~图 4。
将复合酶水解所得茶叶蛋白 肽 按 照 1.4.3 节 所述方法进行体外消化, 依次用胃蛋白酶和胰蛋 白酶进行水解。 反应结束后取水解液进行分析,比 较消化前、 后茶叶蛋白肽相对分子质量分布和自 由基清除能力的变化,结果分别见图 5 和图 1~ 图

白于 5 L 反应罐中, 加入 3 000 mL 蒸馏水, 用 5

mol/L NaOH 调节 pH 至 9.0,加入 6.0 g 复合酶 A, 升 温 至 50 ℃ ,恒 温 水 解 4 h ,加 热 灭 酶 (80 ℃ ,15 min);然后将反应液迅速冷却至 15 ℃ ,用 5 mol/L 盐酸调节 pH 至 3.5, 于 15 ℃ 静 置 30 min , 然 后 10 000 r/min 离心 5 min ,收集上清液,用旋转蒸发

4 所示。

54

中 国 食 品 学 报
对比图 5 中 A 、B 和 C 的色谱峰可以看出,体

2011 年第 5 期

自由基和亚硝酸根离子的清除率最高分别达

外消化后,茶叶蛋白肽中相对分子质量 10 000 和

99% 、100% 、97% 和 100% ,均显著高于 VC,其 IC50
分别为 0.06、0.2、0.10 和 0.2 mg/mL 。 由此可见,茶 叶蛋白肽对自由基的清除作用明显高于茶多 糖 [15],且 其 所 具 有 的 自 由 基 清 除 作 用 不 亚 于 茶 多 酚[16]。 体外消化实验结果表明,酶法水解得到的茶 叶蛋白肽中的绝大多数组分不能被胃蛋白酶和胰 蛋白酶继续水解。 体外消化后,其抗氧化性和自由 基清除能力不会显著降低。 本实验制备的茶叶蛋 白肽是一种高效的天然抗氧化剂和自由基清除 剂,可广泛应用于食品和保健品。

1 000 附近的组分峰减小、增大,并产生少量的游
离氨基酸, 但凝胶色谱图的总体峰型没有显著变 化, 说明茶叶蛋白肽中只有少量的大分子多肽被 胃、胰蛋白酶水解为小分子多肽,其大部分组分不 能被水解,这对于茶叶蛋白肽作为功能性食品、食 品添加剂和保健品具有决定性的意义。 由图 1~ 图 4 可知,茶叶蛋白肽具有很强的抗 氧化活性和自由基清除能力, 其在较低浓度下就 能起作用,对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH

第 11 卷 第 5 期

茶渣资源的开发与利用—— —茶叶蛋白肽的功能性研究

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2.2

茶叶蛋白肽的抗凝血活性 血液凝固过程是由一系列凝血因子协同作用

表1

茶叶蛋白肽缓血液凝集的效果

的结果。 形成正常的血块是体内最大限度减少出 血和止血的关键, 然而血凝机制亢进则导致形成 血栓或微栓子。 临床研究发现急性脑梗塞病人具 有抗凝系统紊乱的症状, 说明凝血机制异常也是 脑梗塞的危险因素之一。 因此,通过影响凝血过程 中的某些凝血因子而阻止凝血过程的药物, 在防 治血管内栓塞或血栓形成方面起重要的作用。 有研究表明, 某些蛋白肽具有抗血液凝集的 作用,可以防止血栓形成。 大分子蛋白由于其免疫 原性限制了其在临床上的使用。 复合酶水解茶叶 蛋白所得茶 叶 蛋 白 肽 多 为 相 对 分 子 质 量 在 600~

Table 1

The relaxation effect of Tea peptide on blood agglutination
全血复钙时间(RT )

样品 对照 茶叶蛋白肽 柠檬酸钠
注:样品质量浓度均为 3mg/mL 。

3 min 40 s 11 min 20 s 5 min 20 s

功能, 影响体液免疫功能和影响细胞免疫功能的 实验方法。 确定样品具有免疫活性的方法是:任意 一实验测定项目中的两个实验结果均为阳性 ,或 任一试验的两个剂量组结果呈阳性, 可判定免疫 功能测定结果为阳性。 本实验中采用影响非特异 性免疫功能实验来确定茶叶蛋白肽对小鼠免疫功 能的影响, 而影响非特异性免疫功能实验包括免 疫器官重量法和单核吞噬细胞功能测定法。

6 000 Da 范围的小分子肽, 大大降低了免疫原性
发生的可能。 通过测定茶叶蛋白肽的全血复钙时 间(见表 1),对其抗凝血活性进行分析。 从表 1 可以看出, 在相同浓度下茶叶蛋白肽 的全血复钙时间明显延长,优于抗凝剂柠檬酸钠, 说明茶叶蛋白肽具有很高的抗血液凝集活性 ,对 血液凝集过程有一定的抑制效果, 这对于预防和 治疗心血管疾病具有重要的意义。

2.3.1

小鼠免疫器官质量

连续给药 14 d, 于末

次给药后次日脱颈处死小鼠,取出脾脏及胸腺,精 确称量。 计算胸腺指数和脾指数, 结果如表 2 所示。

2.3

茶叶蛋白肽的免疫活性 增强免疫力功能判定包括影响非特异性免疫

56

中 国 食 品 学 报
表2 茶叶蛋白肽对小鼠胸腺、脾脏质量的影响(x±s ) 軈

2011 年第 5 期

Table 2
组别 生理盐水(空白对照组) 茶叶蛋白肽(低剂量组) 茶叶蛋白肽(高剂量组) 茶叶蛋白肽 + 氢化可的松 氢化可的松(阳性对照组)

軃 The effect of Tea peptide on the weight of mouse thymus and spleen (x ±s )
剂量 胸腺指数(mg/10 体重) 脾脏指数(mg/10 体重)

0.5 mL 0.375 g/kg 0.75 g/kg 0.75 g/kg+20 mg/kg 20 mg/kg

18.134.67 17.693.84 21.978.55 10.191.95 6.652.70 **

39.164.08 46.276.16 * 50.7310.64 * 38.467.13 36.865.13

注:与对照组比较,*P<0.05 ,**P<0.01 。

由表 2 可知, 茶叶蛋白肽对小鼠脾脏的质量 指数有较大影响。 对照组与高剂量组及低剂量组 之间差异性显著, 说明茶叶蛋白肽有利于小鼠脾 指数的增大。 茶叶蛋白肽对小鼠胸腺指数影响较 小, 空白对照组与高剂量组、 低剂量组差异不显 著。 由表 2 还可以看出,茶叶蛋白肽 + 氢化可的松 组对小鼠脾指数及胸腺指数均无显著影响, 与氢 化可的松组间差异不明显,但茶叶蛋白肽 + 氢化可 的松组小鼠脾指数及胸腺指数均比氢化可的松组 大, 说明在一定程度上茶叶蛋白肽能对抗氢化可

的松的免疫抑制作用。

2.3.2

小鼠单核细胞的吞噬功能

连 续 给 药 14

d,于末次给药 30 min 后尾静脉注射刚果红,然后
于不同时间 (2 min 、10 min ),用 吸 管 (预 先 用 肝 素 溶液润湿)从小鼠眼眶后静脉丛取血 20 μL ,溶于

2 mL 0.1% Na2CO3 溶液中摇匀,用分光光度计测 定波长 520 nm 处的光密度(OD )。 最后将小鼠脱
颈处死,称重。 剥取脾脏、肝脏,分别精确称量,计 算廓清指数 K 或校正廓清指数 A (吞噬指数 A ), 结果如表 3 所示。

表3

茶叶蛋白肽对小鼠吞噬细胞廓清功能的影响(x±s ) 軈

Table 3
组别 生理盐水(空白对照组) 茶叶蛋白肽(低剂量组) 茶叶蛋白肽(高剂量组)
注:与对照组比较,*P<0.05 。

軃 The effect of Tea peptide on clearance rate of mouse phagocyte (x ±s )
剂量 廓清指数 K (×10-3) 吞噬指数 A

0.5 mL 0.375 g/kg 0.75 g/kg

9.64.4 12.25.1 23.97.4 *

3.900.58 4.220.51 4.780.83 *

由表 3 可知, 茶叶蛋白肽对小鼠单核细胞的 廓清指数 K 和吞噬指数 A 影响显著,其中高剂量 组的 K 值和 A 值均明显高于空白对照组,而低剂 量组的效果不明显。 高剂量组单核细胞的廊清指 数和吞噬指数均为最大。 单核巨噬细胞系统是机体最重要的防御系 统, 它具有强大且迅速的吞噬廊清异体颗粒或某 些可溶性异物的能力, 能够迅速清除体内自身产 生的某些有害物质。 常用的一些颗粒状异物通过 静脉注入小鼠, 经血循环后迅速被单核巨噬细胞 清除,主要被定居在肝和脾脏的巨噬细胞吞噬。 因 此在异物量恒定的情况下, 血液中碳粒的消失速

度能够反映巨噬细胞吞噬异物的能力, 在一定程 度上反映机体非特异性免疫功能。 实验结果表明 采用酶法制备的茶叶蛋白肽, 能够增强小鼠的非 特异性免疫功能,使碳廊清能力明显升高。

3

结论
茶叶蛋白肽具有很强的抗氧化活性和自由基

清除能力,其在较低浓度下也可起作用,对羟自由 基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基和亚硝酸根 离 子 的 最 大 自 由 基 清 除 率 分 别 为 99% 、100% 、

97%和 100%,均明显高于 VC。
茶叶蛋白肽中只有少量的大分子多肽被胃、

第 11 卷 第 5 期

茶渣资源的开发与利用—— —茶叶蛋白肽的功能性研究

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胰蛋白酶水解为小分子多肽, 其大部分组分不能 水解。 经体外消化后,其抗氧化性和自由基清除能 力不会显著的降低, 说明茶叶蛋白肽是一种高效 的天然抗氧化剂和自由基清除剂, 可广泛应用于 食品和保健品中。 茶叶蛋白肽具有很好的抗凝血作用, 当其质 量浓度为 3 mg/mL 时, 其抗凝血作用明显优于抗 凝剂柠檬酸钠, 说明茶叶蛋白肽对血液凝集过程 有一定的抑制效果, 这对于预防和治疗心血管疾 病具有重要的意义。 非特异性免疫活性鉴定结果表明,在 0.375 g/

—脾脏的质量, 并在一定程度上对抗氢化 器官—— 可的松引起的免疫抑制作用。 在 0.75 g/kg 剂量下 其对小鼠单核细胞的廓清指数 K 和吞噬指数 A 均影响显著,能明显加强小鼠单核吞噬功能。 说明 茶叶蛋白肽能显著增强机体的非特异性免疫功 能,对治疗免疫功能障碍性疾病有重要意义。 由于国内外对茶叶蛋白的研究大多集中在茶 叶蛋白的提取、 茶叶蛋白的功能特性和部分生理 活性研究上, 对小分子茶叶蛋白肽及其生物活性 研究鲜见报道, 因此本研究为茶叶蛋白资源的开 发与利用提供了一新思路。

kg 剂量下,茶叶蛋白肽可显著增加小鼠主要免疫


[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9]







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中 国 食 品 学 报

2011 年第 5 期

Development and Utilization of Tea Residue As a Resource —Study on the Functional Properties of Tea Peptides ——
Jin Weigang1 Zhang Yang1 Luo Junlin1 Chen Ping1 Lin Tongbao1 Rao Pingfan2 Ye Xiuyun1,2*
(1Fujian Fuda Biotech CO. , LTD. Fuzhou 350002
2

College of Biological Science and Technology , Fuzhou University , Fuzhou 350002 )

Abstract

The functional properties of tea peptides derived from enzymatic hydrolyzate of tea protein was studied in

this paper. The results indicated that the tea peptides had high antioxidant activity , it can work at very low concentrations. Its maximum elimination rate on hydroxyl radicals , superoxide radicals and DPPH radicals reached as high as 99% , 100% and 97% respectively. Its antioxidative potency was higher than that of ascorbic acid. The tea peptides also had potent effect on scavenging of nitrite , the IC50 was 0.2 mg/mL , and the elimination of nitrite could reach up to 100%. The results showed that the tea peptides had a high anticoagulation , with the concentration of 3 mg/mL , its anticoagulating action was clearly superior to the common anticoagulant sodium citrate. At the dose of 0.75 g/kg , the effects of tea peptides on immunocyte proliferation and functions of mice were significantly enhanced. Key words tea residue ; tea protein ; enzymatic hydrolysis ; tea peptides ; functional properties

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政策法规

《出口食品生产企业备案管理规定》2011 年 10 月 1 日起实施
《出口食品生产企业备案管理规定》 已获国家质检总局局务会议审议通过。 该新规将于

2011 年 10 月 1 日起实施。
新规要求,出口食品企业应当建立食品安全卫生控制体系运行及出口食品生产记录档案, 保存期限不得少于两年。 同时相关企业应当在每年 1 月底前向其所在地直属检验检疫机构 提交上一年度报告。 若出口食品生产企业在两年内未出口食品的,监管部门将注销其备案证明。 若出口食品生 产企业的出口食品发生重大安全卫生事故, 不能持续符合我国食品有关法定要求和进口国 或地区法律法规标准要求,或者在生产、加工过程中非法添加非食用物质、违规使用食品添加 剂以及采用不适合人类食用的方法生产、加工食品等行为的,将被撤销备案证明,同时出口食 品生产企业 1 年内不得再次申请备案。 此外,若出口企业以欺骗、贿赂等不正当手段取得备案 证明的,在 3 年内不得再次申请备案。
(消息来源:中国食品报)

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