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靶向survivin的siRNA降低人乳腺


山东医药 2010年第 50卷第 52期

靶向 survivin的 siRNA 降低人乳腺癌 M CF 7 耐药细胞株对阿霉素耐受效应的研究
刘正人, 李映良, 武 彪, 涂发妹, 万仁华 ( 南昌大学第一附属医院, 南昌 330006)
摘要: 目的 的耐药性。方法

Adr

探讨靶向构建 su

rv iv in的小干 扰性 RNA ( siRNA ) 能否逆转人 乳腺癌 M CF 7Adr 耐药细胞株 对阿霉素 将已构 建含 siRNA surv iv in真核载体 P cDNA 3 siRNA 通过脂质 体转染入 M CF 7Adr细胞内, 通过 RT 以 surv iv in为靶向的 siRNA 能明显 降低 surv iv in基因 在 M CF 7A dr中的 靶向 surviv in的 siRNA 能有效沉默 surv iv in基因在 M CF 7A dr中的表达, 并

PCR 及 W este rn blot半定量检测 M CF 7Adr转染前后 surviv in mRNA 蛋白表达量 的变化, M TT 法检测不同浓度阿霉素对 M CF 7Adr转染前后增殖抑制率的影响。结果 表达及 M CF 7 对阿霉素的耐药性。结论
Adr

能逆转 M CF 7Adr对阿霉素的耐药性, 为将来在乳腺癌耐药治疗过程中选择基因治疗提供一定的实 验依据。 关键词: surv iv in; 小干扰性 RNA; 乳腺肿瘤; 耐药; 阿霉素 中图分类号 : R 737. 9 文献标志码: B 文章编号: 1002 266X ( 2010) 52 0101 02

目前的研究显示, 恶性肿瘤耐药细胞株的 sur viv in 表达比同源非耐药的肿瘤细胞株表达明显增 高。 2009年 4月 ~ 2010年 2月, 我们通过靶向 sur viv in 的小干扰性 RNA ( si NA) 下调人乳腺癌 M CF R 7 耐药细胞株 surv iv in 的表达, 了解其对阿霉素耐 受效应的逆转作用。 1 材料与方法 1 1 材料 . 人乳腺癌阿霉素耐药细胞株 M CF 7
Ad r A dr

分别对各组细胞 surv iv in mRNA 及蛋白进行半定量检 测, 均以 actin作为内参照, 计算出其比值, 比较其 各组表达量的变化, 其中 RT PCR 中 act in 及 sur v iv in的引物序列如下: act in 上游引物为 5 GTG GACATCCGCAAAGAC 3 , 下游引物 5 GAAAGGGTG TAACGCAACT 3 , 片段大小为 303 bp surviv in 上游引 ; 物 5 GAGGAAACTGCGAAGAAAGTG 3 , 下游引物 5 GGTGGCACCAGGGAATAAA 3 , 片段大小为 127 bp 。 1 2 3 MTT 法检测 将各组细胞以每孔 3 ! 10 / . . m l种植于 96孔细胞培养板中, 在 37 、 % CO2 细 5
5

源 自北 京肿 瘤 研究 所, 由 我 科实 验 室传 代培 养。 TM RPM I 1640 胎 牛 血清 ( FCS ) 、 ipo fectam in e 2000 、 L 脂质体、 G418 二甲基亚砜 ( DM SO )、 甲基偶氮四 、 4 唑蓝 ( MTT )、 阿霉素、 cDNA3, P cDNA3 siRNA 由本 P 实验室构建并保存。 1 2 方法 . 1 2 1 转染 . . MCF 7 细胞株在 37
A dr

胞培养箱中采用含 20 FCS的 RPM I 1640培养液 % 培养 24 h后, 更换培养基, 各组细胞分别加入不同 浓度的 阿 霉 素: 0 01 . 10 . 00 . 00 . 、0 、1 、10 、100 00 . m o l /L, 继续培 养 24 h 后每 孔加 入 MTT ( 10 m g / m l) 10 l , 在细胞培养箱中继续培养 4 h 离心弃上 ,

、% CO2 细胞 5

培养箱中采用含 20 FCS 的 RPM I 1640培养 液培 % 养, 待肿瘤细胞进入对数生长期时将其接种于 6孔培 养板, 待每孔细胞饱和度在转染前达到 90 以上后 % 采用 L ipofectam in e 2000脂质体转染, 按试剂说明书 方法将 P cDNA3空白质粒及 P cDNA3 siRNA 转染入 M CF 7 细胞株内, 经过 G418 800 g /m l筛选后传带 培养, 并分 组为 MCF 7 、 MCF 7 P cDNA3 空 白 质 粒 )、 CF 7 M P cDNA3 siRNA 质粒 )。 1 2 2 半定量检测 . .
A dr Ad r Ad r A dr T M

清, 每孔加入 100 l DM SO, 振荡 10 m in 酶标仪测 , 定 570 nm 处 OD 值, 根据 OD值计算细胞增殖抑制 率。增殖抑制率 = [ 1- ( 实验组 OD值 - 调零孔 OD 值 ) / ( 对照孔 OD 值 - 调零孔 OD值 ) ] ! 100 。 % 1 2 4 统计学方法 采用 SPSS 10 0统计软件处 . . . 理数据, 数据以 x ? s表示, 计量资料组间比较采用 t 检验。以 P # 0. 05为差异有统计学意义。 2 结果 2 1 surviv in 表达 . 各组乳腺癌细胞 surv ivin mR 各组乳腺癌细胞在 101

/neo 组 ( 转染 入

/ si NA 组 ( 转 染 入 R

通过 RT PCR 及 W estern blot

NA 及其蛋白表达量的变化见表 1 。 2 2 乳腺癌细胞增殖抑制率 . 不同浓度阿霉素作用下的增殖抑制率见表 2 。

基金项目: 江西省卫生厅科技计划 ( 20081053) 。

山东医药 2010年第 50卷第 52期
表 1 各组乳腺癌细胞 survivin mRNA 及蛋白表达 ( x ? s)
组别 M CF 7Adr组 M CF 7Adr / neo组 M CF 7Adr / s i NA 组 R surv ivin mRNA 0. 72 ? 0 21 . 0. 67 ? 0 28 . 0. 31 ? 0 13 . * survivin蛋白 1 23 ? 0 32 . . 1 33 ? 0 26 . . 0 45 ? 0 17* . .

3 讨论 surviv in 是凋亡抑制蛋白 ( I P ) 家族的重 要成 A 员, 是目前为止发现最强的凋亡抑制因子, 在抑制细 胞凋亡、 调控细胞周期、 促进细胞增殖分裂、 参与血

注: 与其他两组比较, * P < 0. 05

表 2 各组乳腺癌细胞在不同浓度阿霉素作用下的增殖抑制率 (%, x ? s)
组别 M CF 7Adr 组 M CF 7Adr / neo组 M CF 7Adr / siRN A 组 0 01 m ol /L . 4 28 ? 0. 65 . 5 32 ? 0. 48 . 5 67 ? 0. 74 . 0. 10 m ol /L 6. 21 ? 0 74 . 5. 99 ? 0 82 . 12. 12 ? 2 39 . * 1 00 mo l/L . 18 33+ 4. 23 . 17 43 ? 5. 48 . 28 57 ? 7. 25* . 10 00 m ol /L . 36. 28 ? 6 25 . 38. 27 ? 8 12 . 75. 23 ? 13 78 . * 100 00 . 73. 66 ? 76. 23 ? 92. 28 ? mo l/L 12 56 . 14 76 . 5 22* .

注: 与其他两组比较, * P < 0. 05

管形成等方面发挥着重要作用, 与肿瘤的发生发展 有着极其重要的关系
[ 3] [ 1, 2]

对阿霉素的耐药。提示靶向 surv ivin 的 RNA干扰技术 在乳腺癌尤其是耐药乳腺癌的治疗中具有重要的潜在 价值, 为今后进一步研究提供了必要的实验基础。 参考文献:
[ 1] Fuessel S, H err ann J N ing S, et a.l C hem osens itizat ion of b lad m , d er cancer cel ls by su rvivin d irected ant isen se oligodeoxynu cleot ides and siRNA [ J] . C ancer Lett 2006, 232( 2 ) : 243 254. , [ 2] 闫琳, 符 立梧. Su rviv in 作为 肿瘤 标 志物 和治 疗靶 点 的新 进展 [ J]. 中华肿瘤防治杂志, 2006, 13( 3) : 232 234. [ 3] 林奇, 周士福. su rviv in在乳腺癌新 辅助化疗 中的预期 意义 [ J ]. 中华肿瘤防治杂志, 2007 14 ( 9) : 689 691 , . [ 4] Zaffaron iN, Penn at iM, C olel la G, et a. E xp ress ion of the ant i ap l optotic gene survivin correlates w ith taxol resistance in human ovari an can cer [ J]. C ellM ol L ife Sc, 2002 59 ( 8) : 1406 1412. i , [ 5] 杨华安, 苟欣, 吴跃, 等. RNA 干 扰技 术阻 断 E J 细胞中 su rvivin 基因的表达 [ J] . 重庆医科大学学报, 2008 33( 1 ): 33 36. , ( 收稿日期: 2010 03 21 )

。而且目前的研究也显示

肿瘤患者在多次化疗后其肿瘤组织内 surv iv in 的表 达量明显增高 , 体外实验也显示肿瘤耐药细胞株 的 surv ivin表达 量明显 高于 非耐 药的 同源肿 瘤细 胞
[ 4]

, 提示其与肿瘤组织的耐药也有明确的关系。

RNA干扰是一种高效、 高特异性的基因沉默阻断 技术, 其主要原理是在细胞中转染入核苷酸的 siRNA 或通过质粒表达的 shRNA, 通过序列特异性的降解作 用来特异性地封闭靶基因, 从而影响和下调靶基因 mRNA及蛋白的表达 。本研究应用 RNA 干扰技术 原理, 通过脂质体将针对 survivin基因设计合成含特异 性 si NA 的质粒转染入 MCF 7 内, 了解其对 MCF R 7 耐药的逆转作用。结果表明, 靶向 surv iv in 的 siR NA可以有效地阻断 surv iv in基因在 MCF 7 细胞中的 表达, 并明显提高其对阿霉素的化疗敏感性, 逆转了其
Adr Adr Ad r [ 5]

改良子宫输卵管造影对不孕症的诊治效果
刘西茹, 丘 彦, 桂文武, 王炼炼, 陈 莹

( 重庆医科大学附属第一医院, 重庆 400016)
摘要: 目的 法 的结果。结果 探讨用多功能妇科不孕诊治仪 行复方 泛影葡 胺子宫 输卵管造 影 ( H SG ) 对不孕症 的诊治 疗效。方 418例全部取得满意的实时图象, 其中双侧输 卵管通畅 39例 ( 9. 33% ); 双侧梗 阻 83例 ( 19. 86 ); % 多 功能妇科 不孕诊 治仪行 复方泛 分析我院 418例不孕症患者在数字 X 线机下应用多功能妇科不孕诊治仪自动推注造影 剂复方泛 影葡胺行 H SG

双 侧通而不畅 86例 ( 20. 57 ); 一侧通畅、 % 一侧梗阻 82例 ( 19. 62% ); 一侧通畅、 一侧通而不畅 68例 ( 16. 27% ); 一 侧梗阻、 一侧通而不畅 60例 ( 14 35% )。术后随访 1 a内妊娠者共 42例。结 论 . 影葡胺 H SG 对不孕症患者既有诊断作用又有一定治疗作用。 关键词: 子宫输卵管造影术; 不育, 女 (雌 )性; 妊娠 中图分类号 : R 711. 6 文献标志码: B 文章编号: 1002 266X ( 2010) 52 0102 03

近年来不孕不育发病率不断增加, 其中女性因素 占 40 ~ 55 % % 102
[ 1]

孕症患者常用的检查方法。近年来, 我们对不孕不育 妇女应用改良多功能妇科不孕诊治仪行复方泛影葡

。子宫输卵管造影 ( H SG) 是女性不


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