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siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究


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siRNA?表达载体与阳离子脂质体复合物转染? HepG2.2.15 细胞实验研究*
杨慧 刘明社 张国英 张芸 赵中夫
山西长治医学院肝病研究所(046000)?
E?mail:zhaozf_1226@163.com?

摘 要: 目的 观察针对 HBV X

的 siRNA 表达载体 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体的 复合物对 HepG2.2.15 细胞转染效果及其对 HBVM 表达的影响。 方法 以 pGenesil-siAFP 表 达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体的复合物转染 HepG2.2.15 细胞,荧光显微镜下观察并计算 转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后 24、48、72 小时采用时 间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中 HBsAg 和 HbeAg。结果 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体复合物 8μl:2.5μg 剂量配比组的平均转染率达到了 55.1±4.3%,且不 影响细胞活性; 转染后 48 小时和 72 小时后该 siRNA 表达载体对 HepG2.2.15 细胞表达 HBsAg 和 HbeAg 抑制作用显著(P<0.05);结论 8μl:2.5μg 剂量配比组的 pGenesil-HBV X 与 阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制 HepG2.2.15 细胞表达 HBsAg 和 HbeAg。 关键词:siRNA,转染,阳离子脂质体,HepG2.2.15 细胞?

1.? 引 言
RNA 干扰技术,是由 21~23nt 组成的双链 RNA 介导的、序列特异性诱发同源基因转录 后沉默(post-transcriptional gene silence , PTGS)的技术。这一技术为抗病毒治疗提 供了新策略
[1-3]



在已报道应用 RNAi 抑制乙肝病毒的实验中大多采用体外转录合成 siRNA 或构建 siRNA 表达载体与病毒基因表达载体共同转染目的细胞的方法
[4,5]

。这些研究注重对转染阳性细胞

靶基因的抑制效果,较少考虑转染阳性率。为使 RNAi 抗病毒治疗试验研究能为它的实际应 用提供更有用的证据, 我们采用了与共转染不同的试验条件, 选用可以持续分泌 HBV 各种病 毒标志物及 HBV-DNA 的 HepG2.2.15 细胞为实验对象,仅转染 siRNA 表达载体,对培养于同 一体系中的转染细胞与未转染细胞上清液 HBVM 进行检测。探讨不同配比浓度 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体 Metafectene 的复合物转染 HepG2.2.15 细胞的转染效率和 RNAi 的抗 HBV 作用。

*

本课题得到山西省自然基金(项目编号:20051114)资助。

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2.?材料与方法?
2.1? 主要试剂:高糖型 DMEM 培养基购自美国 GIBCO 公司,新生牛血清购自杭州四季
青生物制品公司,Metafectene 转染试剂购自德国 BIONTEX, HBsAg、HBeAg 荧光免疫分析 试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。?

2.2?HepG2.2.15 细胞的培养及准备:HepG2.2.15 细胞由北京大学医学部病毒研究
室惠赠,本室传代与培养。HepG2.2.15 细胞生长于高糖型 DMEM 中(含 10%新生牛血清、 2mmol/l 谷氨酰胺、100U/ml 青霉素及 100μg/ml 链霉素),并在 37℃、5%CO2 孵箱中进行 培养。细胞自复苏后,3-4 天规律传代,随传代次数的增加连续监测相同种植密度细胞上清 液中病毒标志物的变化,传至 7~8 代时病毒表达及复制水平达 HBV-DNA 达 10 拷贝时,开 始用于实验。 转染前选择对数生长期细胞, 0.25% 胰酶-0.02% EDTA 消化后吹打成单细 用 胞悬液,以 4×10 密度培养于放置了无菌处理盖玻片的 6 孔培养板中,每孔 2ml。24 小时 后观察细胞生长铺满孔底面积约 70%时用于转染。?
5 7

2.3? 靶序列的选择:针对 HepG2.2.15 细胞 HBV X 区选择作用靶点。为了避免只选择
一个序列可能出现无效或低效的情况,我们选用在 Amir shlomai 的 RNAi 抗 HBV 实验中被证 实 有 效 的 1649 i — GGTCTTACATAAGAGGACT — 为 靶 点 。 同 时 以 AFP 1275i — GCATTGGCAAAGCGAAGCT—为与 HBV 无关的内对照作用位点(已经本室证实有效,另文报道)。?

2.4?SiRNA?表达载体的构建:构建质粒载体 pGenesil-siHBV X 插入的 DNA 模板序
列为: 5’-GATCCGGTCTTACATAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTTGTCGACA-3’(正义 链),3’-GCCAGAATGTATTCTCCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATTCTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’ (反义链);构建质粒载体 pGenesil-1-siAFP 插入的 DNA 模板序列为: 5’-GATCCGCATTGGCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTTGCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3’(正义 链),3’-GCGTAACCGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAACGGTTACGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’ (反义链) pGenesil 质粒载体上游限制性酶切位点为 BamHI, 。 下游限制性酶切位点为 Hind Ⅲ。 以重组有 EGFP 的 pGenesil-1-siAFP 作非特异性序对照组。 两种载体质粒的构建及酶切 鉴定、DNA 序列分析由武汉晶赛生物工程公司协助完成。?

2.5? 质粒载体的转染: 转染试剂 Metafectene 与 pGenesil 质粒载体复合物的剂量配
比在说明书建议范围(2~7:1)内选择, pGenesil-siHBV X 与 META 的复合物按照可获得 最大转染效率的剂量比进行配制。?

2.6? 转染效果观察:荧光显微镜下观察不同配比的转染效果,每孔找三个具有代表
性的视野, 各观察 100 个细胞, 计算阳性细胞百分率, 确定出 RNAi 实验的最适 Metafectene / pGenesil 比例。?

2.7? 细胞活性测定: 0.4%的台盼蓝拒染实验评估细胞活性。 每样本随机取三个视野,
计数其中着色细胞。细胞活力=(总细胞数—着色细胞数)÷总细胞数×100% 。

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2.8?HepG2.2.15 细胞上清液中?HBsAg 和?HBeAg?的监测: 采用时间分辨荧光免
疫测定技术(TRFIA)及配套荧光免疫分析试剂盒,分别在转染后 24、48、72 小时对细胞上 清液 HBsAg 和 HBeAg 进行检测。?

2.9? 统计学处理:数据以 X±S 表示,采用 SPSS 13.0 统计软件作方差分析、q 检验,
P<0.05 认为统计学上有显著差异。?

3.? 实验结果?
3.1? 不 同 配 比? pGenesil?siHBV? 质 粒 载 体 与? Metafectene? 脂 质 体 针 对? HepG2.2.15? 细胞转染效率观察及细胞活性测定:在不同配比的转染组中,脂质体转
染试剂剂量越大转染效率越高。 8μl: 在 2.5μg 剂量配比组的平均转染率达到了 55.1±4.3 %,且不影响细胞活性。12μl:2.5μg 组平均转染率虽也达到 57.7±3.5%,但该组细胞 活性下降(见图 1)。15μl:5μg 组细胞发生崩解呈碎片样,无法计算转染率,提示该剂 量配比的细胞毒性作用。
120.00% 100.00% 80.00% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 3μl:1μg 6μl:1μg 8μl:2.5μg 12μl:2.5μg

转染效率 细胞活性

图?1.不同配比转染组转染效率及细胞活性比较?

3.2?成功转染后,HepG2.2.15?细胞上清液中两种? HBVM?HBsAg?和? HBeAg? 时间分辨荧光免疫测定结果显示:以空白对照组对两种 HBVM 的测定值为标准,转染后
24 小时,pGenesil-siHBV X 组 HBsAg 和 HBeAg 的测定值分别与空白对照相比无显著性抑制 作 用 ( P > 0.05 ) ; 转 染 后 48 小 时 和 转 染 后 72 小 时 的 测 定 值 分 别 与 空 白 对 照 及 pGenesil-siAFP 组相比有显著性抑制作用(P<0.05); pGenesil-siAFP 组对两种 HBVM 表达无显著影响(P>0.05)(见表 1)。 表?1. pGenesil?siHBV?X 抑制?HepG2.2.15 细胞表达?HBsAg 和?HBeAg 作用(χ±s)? HBsAg? HBeAg? 孔 组别 数 24小时 48小时 72小时 24小时 48小时 72小时

空白孔 3 7.13±0.20 14.43±0.56 22.5±21.14 siAFP 3 6.33±0.35a 13.70±0.73a 23.11±1.25a siHBV 3 5.97±0.13a 10.25±0.32b 15.26±0.88b

0.43±0.02 0.75±0.06 1.12±0.10 0.47±0.05a 0.76±0.08a 1.10±0.12a 0.43±0.02a 0.46±0.01b 0.64±0.04b?

a:与空白对照相比?P>0.05,? b:与空白对照及?pGenesil?siAFP 组相比?P<0.05?

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4.?讨论
评价某种抗病毒治疗效果的重要环节之一就是要建立一种稳定的、 接近自然感染状态的 体外模型。 Amir shlomai[6]用 pSUPER-siHBV X 同含 1.3 倍 HBV 基因组的重组质粒 (pHBV1.3) 共转染 Huh-7 细胞,72 小时后检测 HBsAg 和 HBcAg 表达水平分别下降 60%、 89%, 所有病毒 转录物减少约 68%, HBV DNA 复制水平下降 95%。Xiaonan Zhang 将整合有 HBV 全基因组 的质粒 pHBV3.8 与 HBVsiRNA 表达载体 pHBV 共转染 Huh-7 细胞, 小时后观察 HBsAg 和 HBeAg 48 表达水平平均下降 60%,72 小时分别下降 86%和 83%;重庆医科大病毒研究所的唐霓等
[8] [7]

用 pHBV1.3 与 psiHBV 共转染 HepG2 细胞,48 小时后观察对细胞上清中 HBsAg、 HBeAg 的抑 制率分别达 92%、85% 。以上研究均选择转染目的细胞在获得针对靶基因的 siRNA 的同时 也获得了 HBV 重组质粒,即 siRNA 是在 100%转染效率的基础上发挥作用的,以上研究虽可 以较为准确地评估和观察 siRNA 抗病毒作用的特异性和效率。 但是目前的各种转染方式并不 能保证实验体系中所有的细胞均被转染, 实验结果并不能反映这一技术对 HBV 自然感染状态 下相关基因的表达受抑制情况,距该技术应用研究还存在一定的差距。因此,进一步探讨特 异性 siRNA 对靶细胞的转染率仍是值得研究的问题。本试验结果显示 8μl:2.5μg 剂量配 比组的 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体复合物对 HepG2.2.15 细胞转染的安全性和有效性, 为本方法的进一步应用提供了有用的依据。 HepG2.2.15 细胞系可以成功表达 HBV 的全部病毒标志物, 包括 HBV DNA、 HBsAg、 HBeAg、 HBcAg、HBV DNA P 以及大量病毒的复制中间体 。从转染细胞的全部上清液及细胞裂解物中 已经证实了完整乙肝病毒 Dane 氏颗粒的存在。因此,HepG2.2.15 细胞是目前比较成熟的抗 HBV 研究体外培养细胞模型。 我们的实验选用 HepG2.2.15 细胞为研究对象, 使转染了 siRNA 表达载体的细胞与未转染细胞在同一体系中培养,观察 RNAi 对整个培养体系的作用。这不 仅在试验方法上简化了共转染需要转染把序列病毒质粒的过程,其结果也比较接近对 HBV 自然感染状态的作用。更有利于对本方法的实际抗病毒效果作出较客观的评价。 本实验于转染后 48、72 小时检测到 HepG2.2.15 细胞上清液中 HBsAg 和 HbeAg 值抑制 作用不及既往选择相同靶序列的 Amir shlomai 共转染试验结果 。但若以转染效率为 55.1 %来估算对被转染细胞的作用,48 小时和 72 小时后对 HBsAg、HBeAg 的抑制效果与 Amir shlomai 共转染试验结果则几乎一致。进一步证实了所选靶序列抗 HBV 作用的特异性和本方 法的有效性。因目前尚没有可以达到百分之百转染率的转染试剂,Masayoshi Konishi
[10] [6] [9]



抗 HBV 的实验中分别用 HBV PA-siRNA、HBV PreC-siRNA、HBV S-siRNA 同阳离子脂质体 Oligofectamine 的复合物转染 HepG2.2.15 细胞, 发现在转染效率为 60%的情况下, 转染后 第三天检测细胞上清液中 HBsAg 含量, 上述三种质粒的抑制效果都不明显, 但如果在第四天 进行第二次转染, 第七天时观察 HBsAg 含量则分别明显下降。 提示增加给药次数可以显著提 高抑制率。增加给药次数的效应是通过提高转染率,还是通过使已转染的细胞再次转染,增 强了对再次转染细胞的抑制作用目前尚不清楚。值得进一步研究。 参考文献
[1]. Fire A , Xu S , Montgomery MK , et al . Potent and specific genetic interference by dsRNA

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in caenorhabditis elegans [J]. Nature , 1998 , 391 : 806~811. [2]. Brummelkamp TR , Bernards R , Agami RA , et al .A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J] . Science , 2002 , 296 (5567) : 550~553. [3]. Sui GH , Soohoo C , Shi Y , et al . A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells[J] . Proc Natl Acad Sci USA , 2002 , 99 (8) :5515~5520. [4]. Paddison PJ , Caudy AA , Hannon GH . Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells [J] . Proc Natl Acad Sci USA , 2002 , 99 (3) : 1443~1448. [5]. Jenn-Yah Yu , Stacy L DeRuiter , David L Turner . RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammlian cells[J] . Proc Natl Acad Sic USA , 2002 , 99 (9) : 6047~6052. [6]. Shlomai A ,Shaul Y. Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interferenc .[J].Hepatology ,2003,37(4):764~770. [7]. Xiao-Nan Zhang , Wei Xiong , Jia-Dong Wang , et al . siRNA-mediated inhibition of HBV replication and expression . [J] World Journal of Gastroenterology . 2004; 10(20): 2967-2971. [8]. 唐霓,黄爱龙,张秉强,闫歌,Tong-Chuan He,应用 RNA 干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达 的实验研究 [J] 中华医学杂志,2003;83(15):1309-1312. [9]. Sell,M.A.,Chen,M.L.,Acs,G. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Pron.Natl.Acad.Sci.USA. 1987,84:1005-1009. [10]. Konishi M , Wu.C.H ,Wu.G.Y. Inhibition of HBV replication by siRNA in a stable HBV-producing cell line[J]. Hepatology. 2003,38,4:842-850.?

Experiment?on?siRNA?Plasmid?Vector?and? Lipid?Complex?Transfecting?HepG2.2.15?Cells?
Yang?Hui,?Liu?Mingshe,?Zhang?Guoying,?Zhang?Yun,?Zhao?Zhongfu?
Institute?of? ? Hepatology?Changzhi?Medical?College,Shanxi,China?(046000)? Abstract?
Objective:? To? observe? the? ratios? of? pGenesil?HBV? X? and? lipid?complex? (Metafectene)? transfecting?HepG2.2.15?cells,?and?the?effect?of?inhibiting HBVM?expression.?Methods:?Control?groups:? pGenesil?siAFP? and? non?transinfected? HepG2.2.15? cells.? Transinfecting? HepG2.2.15? cells? by? using? different? ratios? of? pGenesil?siAFP? and? Metafectene,? to? caculate? the? percents? of? trasinfected? cells? by? fluoroscope? and?get?the? proper?ratio? of? the? angent.? After? 24、48、72?hours?,?the? expression? of? HBV? surface?antigen?(HBsAg)?and?e?antigen?(HBeAg)? ? secreting?into?the?supernatant?were?determined?with? Time?resolved?Immunofluorometric?Assay?kit?(TRFIA)?.?Results:?The?proper?ratio?of?pGenesil?siAFP

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and? Metafectene? is? 8μl :2.5μg? (55.1±4.3%? cells? transinfected).? ? pGenesil?HBV? X? could? significantly?reduce?HBV?antigen?expression?in?supernatant?of?HepG2.2.15?after?transfection?48?and?72? hours(P<0.05).? Conclusions:? 8μl:2.5μg? is? proper? ratio? of? pGenesil?siAFP? and? Metafectene? transinfecting?cells,?which?inhibited?HepG2.2.15?expressing?HBVM.? Keywords:?siRNA?,?Transinfection,?lipid?complex,?HepG2.2.15?cells? 杨慧:女。1978 年出生,硕士研究生,主要从事 siRNA 技术研究。

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