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细胞穿透肽Tat—LK15介导siRNA的转染效率和细胞毒性研究


细胞穿透肽 Tat—LK15 介导 siRNA 的转染效率和细胞毒性研究 摘 要:通过与 Lipofectamine TM RNAiMAX(Lipo)比较,探讨细胞穿透 肽 Tal-LK15 对人肾上皮细胞(human enbryonic kidney 293T cells,293T)和大鼠 视神经节细胞 (retinal ganglion cell ling, RGC-5) 转染小干扰 RNA (smallinterfernce RNA , siRNA )的效率和细胞毒性,为后期实验提供依据。以羧基荧光素 (carboxyfluorescein,FAM)标记的 siRNA 为报告基因,不同剂量的 Tat-LK15 (Tat-LK15 组)和 Lipo(Lipo 组)为转染试剂,分别转染 293T 和 RGC-5 细胞 转染 24 h 后荧光显微镜观察 FAM 荧光强度,计算转染效率,并以 CCK-8 法检 测细胞毒性。 随着 Tat-LK15 和 Lipo 剂量的增加, siRNA 转染效率逐渐提高。 当 Tat-LK15 与 siRNA 配比为 2:1(μg/μg)时,RGC-5 细胞的转染效率达到最高 ( (87.3± 4.5)%) ,低于 Lipo 与 siRNA 配比为 5:1(μL/μg)时的最高转染效率 ( (96.2± 3.2)%(P<0.05) ) ;作用于 293T 细胞时,两转染试剂的最高转染效率 没有统计学差异( P>O.05 )转染试剂剂量增加, Lipo 细胞毒性显著增加,而 TaI-LK15 毒性无明显变化。转染效率最高时,Lipo(5μL)组 293T 和 RGC-5 的 细胞荷活率仅为( (77.8± 4.1)%, (73.4± 7.7)%)显著低于 Tal-LK15 (2:1) 组同种细胞的存活率( (91.0± 3.7)%.(90.0± 6.1)%) (P<0.05) Tat-LK15 可有 效地转染 siRNA,细胞毒性低,安全性突出.有一定的应用前景。 关键词:细胞穿透肽(CPPs) :Tat-LK15;转染试剂:小干扰 RNA RNA 干扰技术在生物医学研究中已被广泛应用,而转染试剂作为其关键因 素一直得到大量关注。常用的小干扰 RNA (siRNA)转染方法有病毒载体法、 阳离子脂质体介导法和阳离子聚合物法。病毒载体转染效率高,但其制备过程复 杂、价格昂贵,免疫原性和生物安全性问题也限制了它的应用。阳离子脂质体细 胞毒性相对较高,亦可能干扰细胞代谢。动物实验表明,在体使用阳离子脂质体 可诱发肺部炎症,甚至产生严重肺损伤。阳离子聚合物安全窗小,当需要提高转 染效率而增加转染试剂剂量时,会明显增加其生物毒性。细胞穿透肽是一类由 30 个或更少氨基酸组成的富含碱性氨基酸、带正电荷的短肽,可高效介导小分 子(蛋白、肽、核酸等)进入不同类型的细胞而发挥生物活性。作为载体工具, 细胞穿透肽在基因治疗及新药开发等领域具有很大的研究和应用价值。 HIV-Tat 是一段由人类免疫缺陷病毒 I 型基因编码的反式转录激活因子 (transactivator oftranscription, Tat) ,具有细胞穿透肽活性,能将与之连接的核 酸、 多肽等以浓度依赖的方式高效快速地导入胞内,且不影响细胞的正常结构和 功能;具有转染效率高、毒性低、稳定性好等优点。本实验为提高 Tat 的转染效 率,选择 Tat 蛋白中具有穿膜功能的核心氨基酸序列(49~57,RKKR-RQRRR) 与 膜 活 化 蛋 白 LKI5 ( KLLK

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