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用SiRNA沉默SSAT基因表达降低人A5


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收稿日期:2009-06-08

用 SiRNA 沉默 SSAT 基因表达降低人 A549 肺癌细胞对抗癌多胺 类似物 CPENSpm 的敏感性
韩钰,任玉珊,曹春雨,任东明,周永芹,王艳林* (三峡大学医学院分子生物学研究所,
摘要:目的
湖北 宜昌 443002)

探讨精脒/精胺乙酰转移酶(Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase,SSAT)基因表达沉默对多胺类似物 用 SiRNA 技术获得 SSAT 基因表达沉默的人 A549 肺癌细胞株,QT-RT-PCR 法用于

CPENSpm 抗瘤活性的影响.方法 结果

分析 SSAT 基因的表达水平,MTT 法检测细胞的存活率,DNA 片段化分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况. 成功获得 SSAT 基因表达沉默的人 A549 肺癌细胞株. 10 molL1 CPENSpm 处理对照细胞 24 h 可使 SSAT mRNA 用 水平升高 23 倍, 但在 SSAT 表达沉默的细胞中 CPENSpm 无此影响. 细胞增殖实验发现, SSAT 表达沉默的细胞对 CPENSpm (0~20 molL1 )的药物敏感性显著性低于对照细胞.细胞凋亡分析发现,10 molL1 CPENSpm 处理细胞 48 h 导致对照 细胞出现凋亡细胞典型的 DNA 片段化现象和亚凋亡峰,但在 SSAT 表达沉默的细胞株中,CPENSpm 诱导细胞凋亡的能 力明显减弱.结论 CPENSpm 诱导肿瘤细胞内 SSAT 高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一. 文献标志码:A 文章编号:1007-7693(2010)01-0005-06 关键词:精脒/精胺乙酰转移酶;SiRNA;多胺类似物;肺癌细胞;药物敏感性 中图分类号:R979.1; R73-3; R730.5

Silence of Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase Expression by SiRNA Decreases Sensitivity of Human A549 Lung Cancer Line to Antitumor Polyamine Analogue CPENSpm HAN Yu, REN Yushan, CAO Chunyu, REN Dongming, ZHOU Yongqin, WANG Yanlin*(Institute of Molecular
Biology, Medical College, Three Gorges University, Yichang 443002, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the effect of expressive silence of spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT) on the actitumor activity of polyamine analogue CPENSpm (N1-cyclopropylmethyl-N11-ethylnorspermine). METHODS SiRNA technique was used to silence expression of SSAT gene in human lung cancer line A549. QT-RT-PCR was performed to assay the expression level of SSAT genes. The cell proliferation was detected by MTT assay. The apoptosis of A549 cells were evaluated by DNA fragmentation and Sub-G1/flow cytometry assay. RESULTS The A549 cell line in which SSAT expression was silenced successfully was obtained. Treating A549 control cells by 10 molL1 CPENSpm for 24 hours resulted in a 23-folds up-regulation of SSAT expression in mRNA level, but no this effect was observed in SSAT-silence cells. MTT assay demonstrated that SSAT-silence decreased the sensitivity of A549 cells to CPENSpm exposure (0-20 molL1). DNA fragmentation and sub-G1 assay proved the ability of CPENSpm to induce apoptosis only in the control A549 cells but not in the SSAT-silence cell line. CONCLUSION Up-regulation of SSAT by CPENSpm is possibly one of the molecular bases for its
基金项目:国家自然科学基金项目(30772590);湖北省教育厅重点研究项目(D200713003) 作者简介:韩钰,女, 副教授 E-mail: fzswangyl@ctgu.edu.cn Tel: (0717)6397179 E-mail: hanyu@ctgu.edu.cn
*

通信作者:王艳林,男,博士,教授

Tel: (0717)6397398

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antitumor activity. KEY WORDS: SSAT; SiRNA; polyamine analogue; lung cancer cell line; drug sensitivity

多胺(腐胺, 精脒, 精胺)是存在于真核细胞且含 高密度正电荷的一类有机小分子,广泛参与胚胎发 育,细胞生长与分化,细胞程序性凋亡以及基因表 达调控等重要的生理病理过程
[1-4] 1

全波长酶标仪为 Thermo 公司产品, Gel Logic-200 凝 胶 图 象 分 析 仪 为 Kodak 公 司 产 品 , Opticn2 Thermal Cycler 为 MJ Research 公司产品.寡核苷 酸链和 PCR 引物合成以及 DNA 测序由上海生物技 术工程有限公司完成. 1.2 SiRNA 质粒构建 依 据 Ambion 公 司 网 站 提 供 的 设 计 软 件 和 SSAT 的编码序列,设计并合成两条互补的寡核苷 酸链(有下划线部分为靶向 SSAT 的序列):5' GATCCCGTGCCGAAAGAGCACTGGATTCAAG AGATCCAGTGCTCTTTCGGCACTTTTTTGGAA A;5' -AGCTTTTCCAAAAAAGTGCCGAAAGAG CACTGGATCTCTTGAATCCAGTGCTCTTTCGG CACGG. 两互补链经退火后,形成的双链 DNA 两端分 别含有 BamHI 和 HindIII 酶切位点的粘性末端. 将 上述退火后的 DNA 片段克隆入 pSilencer2.1-U6 表 达载体中,然后转化 E.coli.DH-5α 感受态细胞,经 氨苄青霉素(50 mgmL1)琼脂平板筛选后,挑取单 个菌落接种液体 LB 培养基过夜振荡培养,提取质 粒进行测序和酶切鉴定. 实验中同时设计两条互补的含随机碱基序列 的寡核苷酸链, 以相同的方法构建质粒用于对照实 验.对照寡核苷酸链的碱基序列为:5' -GATCCA CTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCT ATAACAACGGTAGTTTTTTGGAAA; -AGCTTT 5' CCAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTT GAACACCTATAACAACGGTAGG. 1.3 获得 SSAT 表达沉默的细胞株 取 5 μg pSilencer2.1/SSAT 质粒或对照质粒用 脂质体试剂法转染 A549 人肺癌细胞(100 mm 培养 皿),5 h 后用正常 RPMI-1640 培养基取代转染试 剂, 继续培养 48 h, 然后用含 0.2 gL1 Hygromycin B 的 RPMI-1640 培养基筛选成功转染的细胞.待 出现肉眼可见的单细胞克隆后, 挑取单细胞克隆放 大培养, 实时定量 PCR 法(QT-RT-PCR)鉴定成功抑 制 SSAT 表达的细胞株. 1.4 QT-RT-PCR 用 Tryzol 试剂法从细胞中提取总 RNA,以此 总 RNA 为模板,Oligo(dT)18 为引物,在 M-MLV 反转录酶的催化下合成 cDNA 第一链. 再以 cDNA
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.精脒/精胺乙酰

转移酶(Spermidine/Spermine N -Acetyltransferase, SSAT)是细胞内多胺降解代谢的限速酶,该酶催化 精脒和精胺的乙酰化反应, 生成的乙酰精脒和乙酰 精胺或者在多胺氧化酶的进一步作用下逆向转化 为腐胺, 或者通过膜上的特异通道系统释放到细胞 外. 近年来的研究发现,肿瘤细胞的快速生长极大 依赖于细胞内的多胺含量, 由此通过干扰多胺代谢 而耗竭细胞内的多胺成分, 成为抗肿瘤药物设计和 治疗的新途径[5-7]. 多胺类似物(polyamine analogue)是新近开发 和研究中的一类新型抗癌药物 [8-9],研究发现,部 分抗癌多胺类似物在抑制肿瘤细胞生长, 诱导肿瘤 细胞凋亡的同时, 还伴有对瘤细胞内 SSAT 表达的 但多胺类似物对 SSAT 的诱导是否 快速上调[10-11]. 是该类药物细胞毒性的基础, 仍缺乏相应的实验依 据. 本研究利用 SiRNA 技术在人肺癌细胞株 A549 中使 SSAT 表达沉默, 然后观察 SSAT 表达抑制后细 胞对多胺类似物 CPENSpm (N1-cyclopropylmethyl由此分析 N11-ethylnorspermine)药物敏感性的改变, SSAT 酶活性在介导药物细胞毒性中的重要意义. 1 1.1 材料和方法 试剂与材料 MTT 细胞增殖分析试剂购于 Promega 公司, 碘 化 丙 啶 (propidium iodide , PI) 和 细 胞 培 养 基 RPMI-1640 为美国 Sigma 公司产品,ECL 化学发 光检测试剂为 GE Healthcare 公司产品,SYBR PrimeScriptTM 实时定量 PCR 试剂从 TaKaRa 公司 购入,pSilencer 2.1-U6 载体为 Ambion 公司产品, Lipofectamine 转染试剂获自 Invitrogen 公司.人肺 癌细胞株 A549 获自中国典型培养物保藏中心,多 胺类似物 CPENSpm(分析纯)由美国 Johns Hopkins 大学医学院 Robert A. Casero 教授惠赠,其分子结 构式如下:

其它试剂为 Sigma 和 NEB 公司产品.EPLCS XL 流式细胞分析仪为 Becman-Coulter 公司产品,
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第一链为模板,用 SYBR PrimeScriptTM 试剂进行 PCR 扩增. 用于特异性扩增 SSAT 的 PCR 引物为: 5' -GGATCAGAAATTCTGAAGAATCTA/5' -ACCC TCTTCACTGGACAGATCAGA;用于扩增内参照 基因β-actin 的引物为:5' -TGGCACCCAGCACAA TGAA/5' -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA. PCR 循环参数为:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40 cycles;72 ℃ 10 min.实时连 续测定基因扩增过程中产生的荧光, 以达到指数扩 增时特定荧光值的循环周数(Ct 值)表示目的基因 mRNA 的表达量.每个样品设 3 个复孔,Ct 取其 均值,以β-actin 作为内参照.基因表达水平变化 的计算方法为: ΔCT = CT(目的基因) CT(β-actin), ΔΔCT = Δ CT(处理组)ΔCT(对照组). 基因表达的相对差异量=2 1.5 MTT 法检测细胞增殖 将对数生长期的细胞接种于 96 孔板中,每孔 50 L(含 2 000 个细胞).37 ℃培养 48 h 后,向孔 内加入不同浓度的 CPENSpm/RPMI-1640 培养基 50 L.培养 48 h 后,去细胞培养液,向每孔内加 入浓度为 2 gL1 的 MTT/RPMI-1640 培养基(无血 清和双抗)100 L,37 ℃继续培养 4 h.去细胞培养 液,每孔加 200 L DMSO,室温振摇 20 min 溶解 结晶.在全波长酶标仪上读取波长为 570 nm 的吸 光值 A. 细胞生存率=A(药物)/A(对照)×100% 1.6 DNA 片段化分析 用 CPENSpm 处理细胞 48 h 后,离心收集细 胞 , DNA 片 段 化 裂 解 液 (50 mmolL1 Tris-HCl pH 8.0,20 mmolL1 EDTA,0.5% Triton X-100) 在 4 ℃条件下裂解细胞 20 min.12 000 rmin1 离 心 10 min 去除细胞核, 将上清转入新的离心管中, 经等体积酚/氯仿抽提后,用 1/10 体积 3 molL1 醋酸钠(pH5.2)和 2 倍体积无水乙醇沉淀上清中的 核酸. 将沉淀溶于 0.1XSSC 缓冲液后, 加入无 DNA 酶的 RNase 37 ℃消化 30 min,加 NaCl 至终浓度 为 1 molL1,等体积酚/氯仿再次抽提,乙醇沉淀, 1.5%琼脂糖凝 最后将 DNA 片段溶解于 ddH2O 中, 胶电泳分离,EB 染色. 1.7 流式细胞法检测细胞周期 用 CPENSpm 处理 48 h 后收集细胞, 用含 80% 乙醇的固定液(每毫升固定液含无水乙醇 0.8 mL,
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-ΔΔ CT

PBS 0.19 mL,0.5 molL1 EDTA 0.1 mL )固定 1 h, PBS 洗涤细胞 1 次,再加入 500 L 细胞裂解液(每 毫升细胞裂解液含 PBS 0.85 mL,1% Triton X-100 0.1 mL,10 gL1 RNase 50 L)和 0.5 gL1 PI 染色 液 100 L,室温避光保温 30 min 后,经流式细胞 仪分析细胞周期. 2 2.1 结果 构建 SSAT SiRNA 质粒 依据 SSAT 编码区 DNA 序列设计合成 2 条互 补寡核苷酸链,经退火后产生的 DNA 双链被克隆 入 SiRNA 载 体 pSilencer2.1-U6 中 . 重 组 质 粒 pSilencer2.1/SSAT 和对照质粒经 DNA 测序鉴定, 插入片段的碱基序列和插入方向无误, 见图1. 在 细胞内, 载体上的 U6 启动子将指导转录出含 SSAT 靶序列的小分子 RNA,后者自身折叠生成颈环结 构, 然后在细胞特定酶系统的作用下,剪切出靶向 SSAT 的 SiRNA 小分子.

.

图1

SiRNA 质粒插入片段的 DNA 测序分析

A-质粒 pSilencer2.1/SSAT 中的插入片段,方框内为 SSAT 靶向 DNA 序列;B-质粒 pSilencer2.1/control 中的插入片段,方框内为随机对照 DNA 序列

Fig 1

DNA sequencing assay of SiRNA plasmids

A-Insert DNA fragment in plasmid pSilencer2.1/SSAT, the sequence in the box is SSAT target sequence; B-Insert DNA fragment in plasmid pSilencer2.1/control, the sequence in the box is scramble sequence.

2.2

获得 SSAT 表达沉默的细胞株 用 pSilencer2.1/SSAT 质粒和对照质粒分别转

染人肺癌细胞株 A549, 经抗生素 Hygromycin B 筛 选后获得单细胞克隆.提取单克隆细胞株中的总 RNA,用此总 RNA 为模板,QT-RT-PCR 法鉴定 细胞中 SSAT 的相对表达水平.结果显示,在筛选
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出的一株 pSilencer2.1/SSAT 质粒转染的细胞内, SSAT mRNA 基础表达水平与对照质粒转染的细 胞比较下降 34%,见图 2A.10 molL 多胺类似 物 CPENSpm 处理细胞 24 h 导致对照细胞内 SSAT mRNA 表达水平增加 23 倍,但 pSilencer2.1/SSAT 转染的细胞内 CPENSpm 对 SSAT 表达则无此诱导 作用,见图 2B.上述结果提示,用 pSilencer2.1/ SSAT 转染的细胞内 SSAT 的表达被有效抑制.
1

2.4 SSAT 表达沉默拮抗 CPENSpm 诱导的细胞凋亡 2.4.1 DNA 片段化分析
1

DNA 片段化分析发现,

10 molL

CPENSpm 处理对照细胞 48 h 导致细

胞浆中出现大量凋亡细胞特有的片段化 DNA 分 子,但对 SSAT 表达沉默的细胞株,这种诱导明显 减弱,提示 SSAT 表达沉默能阻止 CPENSpm 诱导 的细胞凋亡,见图 4.

图2

pSilencer2.1/SSAT 质粒转染细胞有效沉默 A549 细胞

内 SSAT 的表达
A-pSilencer2.1/SSAT 质粒转染细胞降低 A549 细胞内 SSAT 基础表达 水 平 ; B-pSilencer2.1/SSAT 质 粒 转 染 细 胞 有 效 拮 抗 CPENSpm(10 mmolL1 处理 24 h)对 SSAT 表达的诱导作用

Fig 2 SSAT expression was silenced efficiently by transfection of pSilencer2.1/SSAT in A549 cells
A-Transfection of pSilencer2.1/SSAT decreased basic expressive level of SSAT; B-Transfection of pSilencer2.1/SSAT inhibited SSAT up-regulation induced by CPENSpm(10 mmolL1 for 24 h)

图4

DNA 片段化检测用于分析 CPENSpm 诱导的 A549

细胞程序性凋亡
MDNA 标准;1对照细胞;2用 10 molL1 CPENSpm 处理 48 h 的对照细胞;3SSAT 表达沉默的细胞;4用 10 molL1 CPENSpm 处理 48 h 的 SSAT 表达沉默的细胞

2.3

SSAT 表达沉默拮抗 CPENSpm 对 A549 细胞 MTT 法检测了 CPENSpm 对 SSAT 表达抑制细

生长的抑制作用 胞株和对照细胞株的生长抑制效应,见图 3.结果 显示,与对照细胞比较,SSAT 表达抑制细胞株对 CPENSpm 细胞毒性的敏感性明显减弱,差异有显 著性意义.

Fig 4 DNA fragmentation was used to assay cell apoptosis induced by CPENSpm
MDNA Marker; 1control cells; 2control cells treated by 10 molL1 CPENSpm for 24 h; 3cells with SSAT silence; 4cells with SSAT silence and treated by 10 molL1 CPENSpm for 24 h

2.4.2

流式细胞-亚凋亡峰分析

为进一步分析

SSAT 表达沉默对 CPENSpm 诱导的细胞凋亡的影 响, 用流式细胞术分析了用 CPENSpm 处理 SSAT 表达沉默细胞和对照细胞后的细胞凋亡率.见图 5. 结果显示, molL1 CPENSpm 处理细胞 48 h 10 后,对照细胞在 G1/G0 峰前出现明显的亚凋亡峰, 细胞的凋亡率为 27.6%.与之不同的是,SSAT 表 达沉默的细胞在经 CPENSpm 处理后, 亚凋亡峰不 明显,细胞凋亡率仅为 5%. 3 讨论 SSAT 是细胞内多胺降解代谢的限速酶,既往 的研究发现, 部分抗癌多胺类似物在抑制癌细胞生 长的同时,伴有对 SSAT 基因的高效快速诱导.鉴 于 SSAT 的高表达一方面加快细胞内肿瘤快速生长 必须的多胺的降解, 同时在此过程中产生有细胞毒 性的活性氧 H2O2,因而人们推测,SSAT 的诱导性 高表达可能是多胺类似物抗癌药理作用的基础. 随
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图3

SSAT 表达沉默拮抗 CPENSpm 对 A549 细胞生长的

抑制作用
注: 0~20 molL1 CPENSpm 处理细胞 48 h, 用 每点代表 x 与对照组比较: 1)P<0.05, 2)P<0.01

± s (n=3),

Fig 3 Silencing SSAT expression prevented cell growth inhibition induced by CPENSpm in A549 cells
Note: The cells were treated by (0-20) molL1 CPENSpm for 48 h, each point represents x ± s (n=3), compared with control group: 1)P<0.05,
2)

P<0.01

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图5

亚凋亡峰分析法用于测定 CPENSpm 诱导的 A549 细胞程序性凋亡

A未经 CPENSpm 处理的对照细胞;B未经 CPENSpm 处理的 SSAT 表达沉默的细胞;C用 10 molL1 CPENSpm 处理 48 h 的对照细胞;D 用 10 molL1 CPENSpm 处理 48 h 的 SSAT 表达沉默的细胞

Fig 5

Sub-G1/Flow-cytometry was used to assay cell apoptosis induced by CPENSpm in A549 cells

Acontrol cells without CPENSpm treatment; Bcells with SSAT silence and without CPENSpm treatment; Ccontrol cells with 10 molL1 CPENSpm treatment for 48 h; Dcells with SSAT silence and 10 molL1 CPENSpm treatment for 48 h

后人们发现,SSAT 基因的表达诱导呈肿瘤细胞株 特异性和多胺类似物的种类特异性,有些多胺类 似物对 SSAT 的诱导作用不明显, 但仍具有显著的 抗癌活性, 因而多胺类似物对 SSAT 的诱导是否是 该类药物细胞毒性的基础,仍需要更多的实验依 据和个性化的药物分析. 本研究利用 SiRNA 技术首先建立了人 A549 肺癌细胞株 SSAT 表达沉默的细胞模型, 然后用此 细胞模型研究 SSAT 诱导性高表达与多胺类似物 CPENSpm 抗癌活性的关系. 结果显示, CPENSpm 处理对照 A549 细胞能诱导 SSAT 基因高表达, 而 在 SSAT 沉默的细胞株中则无此种诱导现象, 提示 SiRNA 成功抑制了 CPENSpm 对 SSAT 的表达诱 导.对比分析 SSAT 沉默的细胞和对照细胞对 CPENSpm 的药物敏感性后发现,SSAT 沉默细胞 对 CPENSpm 细胞毒性的敏感性明显低于对照细 胞,CPENSpm 处理对照细胞可快速诱导细胞发生 程 序 性 凋 亡 , 但 在 SSAT 沉 默 的 细 胞 株 中 , CPENSpm 诱导凋亡的能力被大为降低.上述研究
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结果提示, 多胺类似物 CPENSpm 诱导人肺癌细胞 株中 SSAT 高表达可能是其抗肿瘤药理活性的分 子基础之一.
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收稿日期:2009-03-26

桂花不同溶剂提取物对氧自由基清除作用的 ESR 研究
丁立新,张宇,宗希明,于德成(佳木斯大学药学院,黑龙江
摘要:目的
佳木斯 154007)

研究桂花不同提取物对氧自由基的清除作用.方法

利用不同极性溶剂(水,石油醚,乙酸乙酯,正丁醇) 以

浸提桂花粉后得到不同极性的提取物.通过电子自旋共振(ESR)和自旋捕集技术,以 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基 检测桂花中各组分清除 DPPH 自由基及 O 的能力. 结果 (DPPH)及核黄素光照条件下产生超氧阴离子 O 自由基体系, 2 2 维生素 C 为对照, 桂花水提取物, 石油醚提取物, 乙酸乙酯提取物, 正丁醇提取物及维生素 C 清除 DPPH 自由基能力 IC50 分别为 59.63,53.93,28.33,38.89,40.93 μgmL1;各提取物及维生素 C 对超氧阴离子 O 自由基清除能力 IC50 分别为 2 63.37,55.47,30.20,48.36,41.52 μgmL1.其中各提取物的乙酸乙酯提取物的 DPPH 及 O 清除率最大.结论 2 目的的分离桂花中的抗氧化成分. 关键词:桂花;电子自旋共振技术;自由基 中图分类号:R284.2 文献标志码:B 文章编号:1007-7693(2010)01-0010-04 通过比 较各组分对 DPPH 自由基及超氧阴离子自由基的清除能力,了解桂花中抗氧化成分在各相中的分布情况,并据此进行有

ESR Studies on the Scavenging Effect on Oxygen Free Radicals in Different Extracts from Osmanthus Fragrans DING Lixin, ZHANG Yu, ZONG Ximin, YU Decheng (College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007,
China) ABSTRACT: OBJECTIVE To research scavenging effect on the oxygen free radicals in different extracts from Omanthus fragrans. METHODS Different polar extracts in Omanthus fragrans were obtained by different solvents such as water, petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical and superoxide anion free radical( O ) produced in lactoflavin illumination system were measured by electron spin resonance(ESR) and spin trapping 2 technology. The scavenging effects of different extracts from Osmanthus fragrans were on the DPPH free radical and superoxide anion free radical( O ). RESULTS Based on vitamin C (VC) as a contrast control, aqueous layer, petroleum ether layer, ethyl 2 acetate layer, n-butanol layer and VC whose capacities of DPPH scavenging IC50 (μgmL1) were 59.63, 53.93, 28.33, 38.89, 40.93 μgmL1 in turn; capacities of superoxide anion free radical( O ) scavenging and VC IC50 (μgmL1) were 63.37, 55.47, 30.20, 2 48.36, 41.52 μgmL1 in turn. Among them, capacities of DPPH scavenging and superoxide anion free radical( O ) scavenging 2 from ethyl acetate layer were maximum. CONCLUSION By comparison with capacities of DPPH scavenging and superoxide anion free radical( O ) scavenging, the situation of distribution in each phase was known about antioxidant constituents from 2 Osmanthus fragrans. According to the result, antioxidant constituents were isolated purposively. KEY WORDS: Osmanthus fragrans; electron spin resonance; free radical

桂花 (Osmanthus fragrans) 系木犀科木犀属植 物,其花,果,根均可入药,民间用作止痛剂,治 疗肝胃气痛等.至今为止,人们对木犀属植物桂花
作者简介:丁立新,女,硕士,教授
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已做过不少研究,有关抗氧化研究方面,许多学者 采用了紫外分光光度法, 化学发光法, 碘量法等对 桂花进行了清除超氧阴离子自由基,羟基自由基,

Tel: 13903684801

E-mail: dlx200475@yahoo.com.cn

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