当前位置:首页 >> 自然科学 >>

siRNA的转染


siRNA 的转染

发布日期:2007-4-29

热门指数:3490 收藏

将制备好的 siRNA,siRNA 表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种: 1.磷酸钙共沉淀 将氯化钙,RNA(或 DNA DNA)和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含 DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷 酸钙-DNA 复合物

粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷 DNA 酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离 最优条件十分之一个 pH 都会导致磷酸钙转染的失败。 2.电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。 将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细 胞膜的电压差异, 据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。 电脉冲和场强的优化对于成功的 转染非常重要,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般, 成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高)的毒性。 3.DEAE-葡聚糖和 polybrene 带正电的 DEAE-葡聚糖或 polybrene 多聚体复合物和带负电的 DNA 分子使得 DNA 可以结合在细胞 表面。通过使用 DMSO 或甘油获得的渗透休克将 DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。D EAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 4.机械法 转染技术也包括使用机械的方法,比如显微注射和基因枪(biolistic particle)。显微注射使 用一根细针头将 DNA DNA,RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压 microprojectile 将大分子导入细胞。 5.阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的(平均大小约 100-400nm)单 层脂质体。 这些脂质体带正电, 可以靠静电作用结合到 DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表 面。 因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。 使用阳离子脂质 体试剂,DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上,形 DNA 成 DNA DNA-阳离子脂质体复合物。据称,一个约 5kb 的质粒会结合 2-4 个脂质体。被俘获的 DNA 就 会被导入培养的细胞。现存对 DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。 为了达到高的转染效率,在转染实验过程中,需要注意以下几点: 1.纯化 siRNA 在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的 siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通 过 15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合 成的 RNA 通常需要跑胶电泳纯化(即 PAGE 胶纯化)。 2.避免 RNA 酶污染 微量的 RNA 酶将导致 siRNA 实验失败。由于实验环境中 RNA 酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒 手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受 RNA 酶污染非常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了 优化实验,推荐用 50 代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。 4.避免使用抗生素 Ambion 公司推荐从细胞种植到转染后 72 小时期间避免使用抗生素。 抗生素会在穿透的细胞中积 累毒素。有些细胞和转染试剂在 siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下,可同时用正常培 养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效果。 5.选择合适的转染试剂 针对 siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同, 选择好的转染试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成 功至关重要。 6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的 siRNA 转入靶细胞(同样 适合实验靶 siRNA),转染 48 小时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。过多 的 siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。 7.通过标记 siRNA 来优化实验 荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转染效率。 标记的 siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位 及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞,将转染与靶蛋白表达的 下调结合起来。


相关文章:
siRNA小干扰RNA 转染程序
siRNA小干扰RNA 转染程序_医学_高等教育_教育专区。小干扰RNA的转染步骤siRNA 小干扰 RNA 转染程序将制备好的 siRNA 和其表达载体转导至真核细胞中的方法主要有以...
siRNA实验方法和设计常见问题解答
A:我们的 siRNA 适用于各种转染方法。 转染方法和转染试剂的选择, 需要根据细胞来选 择,对于容易转染的细胞,常用的转染方法是脂质体转染。 Q:对于难转染的细胞,...
RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系
RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系_医药卫生_专业资料。RNAi、miRNA及siRNA的区别 用siRNA 进行 transient transfection 不稳定,几代细胞以后,症状就会消失,所以在转染几...
siRNA 干扰实验步骤(贴壁细胞)
siRNA 干扰实验步骤(贴壁细胞)_生物学_自然科学_专业资料。1. 转染前一天,4-5× 10* 4细胞接种在 24 孔板上, 0.5mL 含 FBS 和抗生素的 DMEM (或 Opti...
用LIPO3000向细胞中转染siRNA
用LIPO3000向细胞中转染siRNA_生物学_自然科学_专业资料。细胞转染,siRNA 用LIPO3000 向 PK-15 细胞中转染 siRNA 以 24 孔板为例。 1 转染前一天细胞消化计数...
ShRNA与SiRNA的综述
ShRNA与SiRNA的综述_基础医学_医药卫生_专业资料。RNA 干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程,该过程通过双链 RNA (dsRNA) 使得目标基因相应的 mRNA 选择...
siRNA解答
转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液, 3.调整细胞的生长状态;一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性; 4.调整转染试剂和 siRNA 的比例;...
lncRNA的功能研究-SiRNA转染服务
lncRNA的功能研究-SiRNA转染服务_生物学_自然科学_专业资料。由于小分子的转染效率较高,使基因功能研究中的 loss-of-function 手段十分有效。 服务内容 (1)根据...
lipo2000转染操作步骤
lipo2000转染操作步骤_理学_高等教育_教育专区。lipo2000转染操作步骤 Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以 24 孔板为例,其余规格的转染见表 1 1 中板,细胞...
RNAi的作用机制及siRNA的合成方法
siRNA 表达载体常用能在哺乳动物 细胞中表达 shRNA 的含有 RNA 聚合酶Ⅲ(polⅢ)启动子的载体[18] , 通过转染含有 RNA 聚合酶 II/III 的启动子 U6 或 H1,...
更多相关标签:
sirna转染的实验步骤 | sirna转染步骤 | sirna转染 | sirna转染原理 | sirna转染试剂 | lipo3000转染sirna | lipo2000转染sirna | lip3000转染sirna步骤 |