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siRNA转染方法


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Entranster -R (用于将 siRNA 转染入动物细胞) 使用手册
Cat. No. 18668-06 Cat. No. 18668-07 Size:0.5ml Size:1ml 常温运输,储存于 4℃ 一 产品介绍 英格恩生物公司(Engreen Biosystem Co,Ltd.)是专业的转染试剂研发生产厂商。 EntransterTM 是英格恩生物公司研发合成的纳米聚合物转染试剂,该试剂采用纳米技 术合成,是最新一代非病毒转染试剂。由于纳米技术的应用,EntransterTM-R 在细胞 转染过程中,表现了卓越的低毒、高效的性能。 本品推荐用于将 siRNA 转染入贴壁动物细胞(如哺乳动物细胞系、昆虫细胞系)。 本品在多种细胞系的验证中均表现了很好的 siRNA 转染效率,并有很低的细胞毒 性, 而较低的细胞毒性对 RNAi 实验尤其重要。 由于 siRNA 的设计、 合成、 工作浓度、 转染时细胞密度、以及转染试剂的量等均影响 siRNA 转染实验的效果,siRNA 的转 染首先须优化条件。 二 条件优化实验(以 24 孔板为例) 1.提前 1 天细胞种植 根据表 1 推荐的细胞数量和培养基量,提前一天将细胞种植在 24 孔板中,以转 . 染时细胞汇合度(Confluence)在 30-40%为宜,转染前全培养基总量为 0.45ml。 ..
表 1 提前 1 天种植细胞数量和培养基体积推荐 培养容器 96‐well 24‐well 6‐well/35 mm 60 mm/T25 flask 100 mm/T75 flask 转染前 1 天接种细胞数量 7 500 ± 2 500 25 000 ± 10 000 150 000 ± 50 000 400 000 ± 100 000 1 000 000 ± 250 000 每孔表面积(cm2) 0.3 1.9 9.4 28 78.5 每孔培养基总体积(ml) 0.1 0.5 2.5 5 10

TM

2.siRNA 有效浓度和转染试剂量的优化 ⑴siRNA 浓度和转染试剂量的优化。根据表 2,取 4 个 EP 管,每管加入相应数量 siRNA, 然后加入一定量无血清稀释液体 (建议采用 OPTI-MEM、 无血清 DMEM ... 或 1640),充分混匀,制成 siRNA 稀释液,终体积为 25μl。
表 2 siRNA 浓度和转染试剂量的优化 1 2 3 4

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siRNA 工作浓度 每孔 siRNA 的量 (pmol) 每孔转染试剂量

25nM 0.17μg (12.5pmol) 0.5μl

50nM 0.33μg (25pmol) 1μl

100nM 0.67μg (50pmol) 2μl

150nM 1μg (75pmol) 3μl

注意: ①对 21nt 双链 siRNA oligo 来说, 平均分子量约为 13300g/mol, 合成 siRNA 其 OD 值和 nmol 换算关系由于 OD 值受产物中其他成分影响,具体请询问合成公 司,一般 1OD duplex≈2.5-5 nmols≈33-66 ug。 ⑵再取 4 个 EP 管,每管按表 2 相应加入 EntransterTM-R,然后加入一定量无血清 ... 稀释液体(建议采用 OPTI-MEM、无血清 DMEM 或 1640),充分混匀,制成 EntransterTM-R 稀释液,终体积为 25μl。室温静置 5 分钟。 ⑶将 EntransterTM-R 稀释液分别加入到对应 siRNA 稀释液中,..... 加入后立即充分混匀 (可用振荡器振荡或用加样器吹吸 10 次以上),室温静置 30 分钟(请保持足够 时间静置)。转染复合物制备完成。 3.转染 ⑴将 50μl 转染复合物滴加到有 0.45ml 全培养基(可含 10%血清和抗生素)的细胞 上,前后移动培养皿,混合均匀。 注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。 ⑵转染后 6 小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养 24-72 小时在 mRNA 水平得到结果,继续培养 24-96 小时在蛋白水平得到结果。 注意:在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出 现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞 状态,可通过换液除去。
表 3 不同细胞培养容器转染推荐用量 细胞培养容器 96-well 48-well 24-well 12-well 6-well/35-mm 60 mm/T25 flask 100 mm/T75 flask 表面积 (cm2) 0.3 0.7 1.9 3.8 10 21 58 表面积相对 每孔 每孔 siRNA 每孔 EntransterTM 每孔培养 于 24-well siRNA 稀释液总体 EntransterTM-R -R 稀释液总 基总量 比率 用量 体积 积 用量 0.2 0.4 1 2 5 10 30 0.15μg 0.3μg 0.67μg 1.33μg 3.33μg 6.67μg 20.0μg 10μl 15μl 25μl 25μl 50μl 125μl 250μl 0.45μl 0.9μl 2μl 4μl 10μl 20μl 60μl 10μl 15μl 25μl 25μl 50μl 125μl 250μl 100μl 200μl 500μl 1ml 2.5ml 5ml 15ml

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注意:由于 siRNA 序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了 siRNA 和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 三 优化条件的应用 根据预实验确定的细胞密度、siRNA 有效浓度和转染试剂量等优化条件,固定 siRNA(μg):转染试剂量(μl)的比值,根据表 3 按培养器皿表面积比例应用到其他培养 容器。 四 其他事项 1. siRNA 有效浓度和转染试剂量的优化。前面的优化方案是最简单的方案。为得到更 好的结果,优化方案每孔 siRNA 量可以从 10nM-200nM 优化,siRNA(μg):转染试 剂量(μl)比值可以从 1:2 到 1:8 进行优化。 2. 细胞密度。不同的细胞密度可能会极大影响转染效率和细胞毒性,为求最佳转染 效果,建议转染时的细胞密度从 20%到 50%进行不同细胞梯度转染,确定最佳转 染数量。 3. 步骤 3(1)*的全培养基量。 由于会影响 siRNA 在培养基中的浓度, 建议采用推荐量。 4. 稀释用液的选择。必须采用无血清液体!建议采用 OPTI-MEM、无血清 DMEM 或 无血清 1640。 5. 培养时间。应用本转染试剂后,由于不同细胞和 siRNA 效率的差异,一般来说, 在 mRNA 水平观察 RNAi 效果的最佳时间是转染后 24-48 小时,在蛋白水平观察 RNAi 效果的最佳时间是转染后 48-72 小时。 6. 细胞生长的培养基。细胞生长的培养基没有特殊要求,可以采用含血清培养基或 加入抗生素。 五 常见问题与解决方案
问题 可能原因 siRNA 与转染试剂比例不佳 细胞密度不佳 转染后沉默 现象不明显 siRNA 效率不高 RNA 酶污染 转染后培养时间不够 siRNA 与转染试剂比例不佳 细胞毒性 细胞密度不佳 培养基毒性 细胞污染 预实验优化 调整细胞密度到转染时汇合度为 20-40% 选择最优 siRNA,并采用已知高效的 siRNA 做对 照 建议无 RNA 酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等 材料和实验器具。 在 mRNA 水平可以到 48 小时以后验证结果,在蛋 白水平可以到 72 小时后验证结果 预实验优化 调整细胞密度到转染时汇合度为 20-40% 采用含 10%-20%血清的全培养基 建议彻底清洁所有细胞培养相关用品 解决方案

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七 储存与安全 本品常温运输,储存于 4℃,有效期 12 个月。 本品使用安全,未发现任何生物、化学毒性。如不慎沾染,用清水冲洗即可。 八 其他相关试剂 EntransterTM-H:用于将 DNA 转染入 HEK 293(T)、Hela、CHO 细胞。 EntransterTM-D:用于将 DNA 高效低毒转染入动物细胞。 EntransterTM-in vivo:用于动物体内转染。 EnlightTM:高灵敏、低背景 ECL 发光试剂。 九 质量保证 北京英格恩生物科技有限公司对 EntransterTM-R 基因转染试剂的每批产品实行严 格质量检验, 并进行转染验证, 以确保产品质量。 请用户使用前务必认真阅读本手册。 十 使用限制 本转染试剂仅限科研用途。

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