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siRNA 干扰实验步骤(贴壁细胞)


1. 转染前一天,4-5× 10* 4细胞接种在 24 孔板上, 0.5mL 含 FBS 和抗生素的 DMEM (或 Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。

2. 选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。 3. 在50μl 的 DMEM(或 Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;

4. 混匀 lipofectamin 试剂,用 50μl 无血清的 DMEM 或 Opti-MEM,或其他无血清培养 基)稀释 1μl lipofectamin 试剂(DNA 转染时,则加入2μllipofectamin 试剂) ,轻轻混匀, 室温放置5分钟;

5. 将稀释好的 siRNA 和 Lipofectamin 试剂混合;轻柔混匀,室温放置 20 分钟 , 以便 形成 siRNA/lipofectamin (或 DNA/lipofectamin)复合物。

6. 将 100μl siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的 培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。

7. 细胞在 CO2培养箱中37℃ 温育24h-48h 后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株 比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。


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