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siRNA实验方法和设计常见问题解答


siRNA 实验方法和设计常见问题解答
转载请注明来自丁香园 发布日期:2012-09-20 11:35 文章来源:丁香园 分享到: 收藏夹 新浪微博 腾讯微博 开心网 豆瓣社区 人人网 关键词: RNA miRNA 技术专题 锐博生物 丁香通 丁香园 点击次数:1080

Q:如何选择转染方法和转染试剂? A:我们的 siRNA 适用于各种转染方法。 转染方法和转染试剂的选择, 需要根据细胞来选 择,对于容易转染的细胞,常用的转染方法是脂质体转染。 Q:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定? A:1)对于贴壁细胞,推荐采用转染试剂转染即可;2)对于难转染的细胞的转染,如何提 高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法,但是由于电转 的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的。 转染效率的确定,常用的是使用荧光标记的 siRNA,通过荧光显微镜,共聚焦显微镜, 流式细胞仪检测的方法。具体可以参考我们的产品说明书。 Q:细胞的转染效率是否与 siRNA 序列相关? A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法,而于 siRNA 的序列并没有直接关系。 因此,siRNA 在不同的细胞转染效率可能不一样。 Q:转染 siRNA 时候的细胞密度多少为宜? A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用 lipofectamine 2000 作为转染试剂,单 独转染 siRNA,30%~50%密度较佳;而 siRNA 与质粒共转染,密度可以到 80%-90%。 Q:siRNA 转染时的培养基要求,可否含血清? A:不同的转染试剂可能有不同的要求,对于 lipofectamine 2000,在配制 siRNA 和 lipofectamine 2000 混合物时不能含有血清,但细胞培养基可以含有血清,但不能含 有抗生素。 Q:siRNA 的储存液体浓度和工作浓度有何区别? A:siRNA 的贮存浓度就是保存的最佳浓度, 锐博推荐的贮存液浓度为 20 μM; 而 siRNA

的工作浓度就是使 siRNA 能够达到最佳沉默效果的转染浓度,一般 10~100 nM 范围 内,锐博生物推荐的转染浓度是 50nM。 Q:转染时该如何分组?分组的目的是什么?

Q:为什么说阳性对照在 RNA 干扰实验中很重要? A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。 也就是说, 当您看到 siRNA 阳性对照的 预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA 提取物和检测方法是可靠 的。 Q:阳性对照及其阴性对照在 RNAi 实验中的作用?如何选择? A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的 siRNA,用于监测实验体 系和实验方法的可行性。我们可以提供的阳性对照 siRNA 有针对 GAPDH,ACTB, GFP/EGFP 有效的 siRNA 作为阳性对照,客户可以根据具体的实验需要选择。阴性对 照往往是非特异的 siRNA, 主要用于说明 siRNA 作用的特异性。 阴性对照的选择可以是 通用的序列(universal)或是随机打乱的序列(scramble),客户可以根据实验要求 选择。 Q:用荧光对照 siRNA 如何检测转染效率?是不是每次实验都必须做? A:我们提供的转染对照 siRNA 带有 Cy3 或 Cy5 荧光标记,可以通过荧光显微镜,共聚 焦显微镜,流式细胞仪等荧光检测仪器检测。 除此之外,还应该通过阳性对照实验进一 步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关,同等实验条件下,每次转染细胞转染效 率应该是相近的,因此可以不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组,将会 更加便于排除一些实验问题。 Q:siRNA 荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段? A:FAM 在 495nm 处有最大吸收率,在 520nm 处有最大发射率。

Cy3 在 550nm 处有最大吸收率,在 565nm 处有最大发射率。 Cy5 在 643nm 处有最大吸收率,在 667nm 处有最大发射率。 Q:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?

Q:到了转染时间发现细胞密度太低,该如时转染还是让细胞多长一天再转染? A:细胞生长需要一定的密度,而转染试剂对细胞有一定的毒性,如果转染时细胞密度过 低,细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性,一般 也不建议用生长几天的细胞做转染。 Q:siRNA 的作用效果应该如何检测? A:通常可以从三个方面来相互验证 siRNA 的作用效果 1) 用 Realtime RT-PCR 方法,从 mRNA 水平检测: 2) 用 Western blot,ELISA 等方法,从蛋白水平的检测; 3)根据目的基因的功能,从细胞表型的水平检测。 Q:siRNA 在细胞内可以作用多长时间?什么时候才是最好的检测时间? A:siRNA 介导的 RNAi 属于瞬时现象,不能稳定传代,一般其作用时间不可能维持很长 时间,通常建议在转染后 3~4 天内完成检测。最佳检测时间,因细胞、目的基因而异, 多在转染后 24~48 小时之间检测。 Q:为什么要强调 mRNA 水平检测?可以直接检测蛋白和功能吗? A:siRNA 直接作用于 mRNA,因此 mRNA 水平检测是最直接在指标。 很多客户认为,mRNA 的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降,因此蛋白水平 的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上,很多情况下往往出现,mRNA 下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有:

1) 与选择的检测时间有关。可能因 mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达 到足以检测的水平,所以一般建议蛋白和功能检测时间要稍稍推后。 2) 与蛋白在细胞中的表达情况有关。mRNA 的翻译过程非常复杂,细胞内基因的表达 总要维持一个平衡,某些蛋白表达量到一定的程度之后,足以维持其细胞功能,将可能 暂时“关闭”表达的功能,转录出来的部分 mRNA 可能不参与蛋白翻译的过程,因此, mRNA 水平的下调与蛋白水平下调并非完全成正相关的关系。 3) 可能还会涉及到更加复杂的机制。 Q:干扰效率多高才是好的靶点? A:没有明确的界定,干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型 的转染效率也不尽相同,不同基因的表达水平也相差较大,主要看干扰效果而定。 Q:沉默效果不理想,应该如何处理? A:最常见的影响沉默效果的两个原因是:转染效率低和 siRNA 序列设计的效果不理想。 如果您初次使用 siRNA 或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染 效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依 然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。 如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求, 可能是因为 siRNA 序列设计的 效果不理想。 Q:siRNA 反而使得目的基因表达上调了,这是什么原因?该怎么解决?

Q:我从阴性对照实验中得到和特异性 RNAi 相同的结果,这说明了什么?

Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样?如果偏差很大该怎么办? A:正常情况下,各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大,只需考虑实验 结果的准确性。另外,对于一些特定的基因,比如与细胞难受压力相关的基因,又如参 与细胞免疫的基因,可能会对外界压力比较敏感,使得各组对照的基因表达发生变化不 一致。 Q:用 100nM 的 siRNA 转染时只得到 50%沉默效率, 我可以把 siRNA 的浓度增加 到 200nM 甚至 400nM 吗? A:当干扰效率不佳时,可以在一定范围内适当优化转染浓度,通常优化的范围是 10~150nM,但不宜过大,高浓度的 siRNA 将可能增加非特异性作用的可能性并对细 胞产生毒性。 Q:同样的 siRNA,为什么在细胞 A 很有效,在细胞 B 则没有效果? A:不同细胞的转染效率不一样、 基因表达水平也不一样, 这些都与 siRNA 的作用效率有 关


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