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Slug-siRNA转染对胰腺癌细胞生长的影响


Slug-siRNA 转染对胰腺癌细胞生长的影响
崔海宁 张克君* 吴幸 王正文

海南医学院附属医院 普外科 517001 [摘要] 目的 研究 Slug 基因沉默后对体内胰腺癌细胞增殖、 凋亡的影响 方法 构 建靶向抑制 Slug 的 siRNA 表达载体,瞬时转染 CaPan-2 细胞。免疫组织化学、 RT-PCR 和 Western blot

法检测细胞 Slug 表达的变化, MTT 检测细胞增殖, Annexin
V-FITC/PI、Hoechst33258 和 PI 双染色染色了解细胞凋亡的变化。结果:成功构

建 了

pGenesil-1-Slug-siRNA(pSlug-siRNA) 和

pGenesil-1-Neg-siRNA

(pNeg-siRNA)表达质粒;质粒瞬时转染胰腺癌 CaPan-2 细胞 72h 后,细胞内 Slug 表达受到明显抑制。Slug-siRNA 细胞的生长受到抑制,并且细胞凋亡率明显增加 结论:Slug-siRNA 抑制 Slug 表达后可以在体外促进 CaPan-2 细胞凋亡并抑制细 胞的增殖。 关键词: Slug;小干扰 RNA;瞬时转染;增殖;凋亡;胰腺肿瘤;CaPan-2 Slug 是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因, 是 PUMA 基因的强烈抑制剂【1-2】 。 本文旨在研究 Slug 基因沉默后对胰腺癌细胞的增殖和凋亡的影响,探讨胰腺癌 基因治疗的新靶点。 材料和方法 1 材料和试剂 :人胰腺癌细胞株 PaCan-2 购自 上海细胞所、pGenesil-1 质

粒购自 Austin,USA、感受态大肠杆菌 DH5α 购自武汉晶赛生物工程技术公司、限 制 性 核 酸 内 切 酶 BamH Ⅰ 、 Hind Ⅲ 、 T4 连 接 酶 为 Promega 公 司 产 品 、 LipofectamineTM2000 为 Invitrogen 公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为 sigma 公司产品、BCA 蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为 Pierce 公司产品;Slug 多克隆抗体及 G3PDH 抗体为 Santa Cruz 公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶 标记二抗为北京中山公司产品。凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波 中鼎公司 ;siRNA 的转录模板由上海生工合成,合成的序列分别为 Slug-siRNA (GenBank accession no. AK223368, 目的片段作用于 Slug 编码区的 523-541

位,下划线表示 19bp) sense: 5-GATCCGACTACAGTCCAAGCTTTCTTCAAGACGTTGATGTCAGGTTCGAAAGTTTTTGAATTCA-3 antisense: 3-CTAGGCTGATGTCCAGGTTCGAAAGAAGTTCTGCAACTACAGTCCAAGCTTTCAAAAACTTAAGT-5 ;Negative-siRNA:( 与人类编码基因序列无同源性的碱基序列,使用 BLAST 方法 排 除 ):sense: 5-GATCCCAGACTTGAAACCCGTTTcTTCAAGACGcTAGTgTCGGATTAAACGGTTTT TGAATTCA-3;antisense:3-GATAGGTTGGACTTGTTTCTAAGTTCTGCACATCCCATGGGCAATT TGAAAAACAGCTGTGCGA-5; 2 质粒的构建:合成的 siRNA 转录模板长度为 64bp,在序列中间为加入 9 个茎环 序列分隔的正反向靶序列,尾端插入 5 个 TTTTT 作为终止序列,上游和下游分别 加了 BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,pGenesil-1 质粒经 BamHⅠ、HindⅢ酶切后与合 成的表达模板 DNA 片段用 T4DNA 连接酶连接(16O°C,8h) ,转化 DH5α 菌株,涂 卡那霉素琼脂平板,挑选阳性克隆,扩增并提取质粒,用 BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴 定,酶切鉴定正确的克隆送上海英骏生物公司测序,测序正确后大量提取质粒. 方法 1 细胞培养:胰腺癌细胞 CaPan-2 购自中科院上海细胞所,细胞用含 10%胎牛血 清的 RPMR1640 培养基培养,细胞培养条件为 37°C 恒温,饱和湿度和 5%CO2,每 2-3 天传代一次,指数生长的细胞为实验对象。 2 细胞瞬时转染:在 6 孔培养板中常规接种 CaPan-2 细胞,待细胞 70-80%融合后, 经 LipofectamineTM2000 介导质粒转染 CaPan-2 细胞 72h(按试剂盒说明操作)。 3 Annexin V-FITC/PI 染色:
收集三组细胞,每组设三个复孔。用去离子水按 1:4 稀释结合缓冲液。用 4℃预冷的 1×PBS 洗 细胞 2 次,用 250?l 结合缓冲液重悬细胞,调节其浓度为 1×106/ml。取 100?l 的细胞悬液于 5ml 流式管中,加入 5?l Annexin Ⅴ/FITC 和 10?l 20?g/ml 的 PI 溶液。混匀后于室温避光孵

育 15min。在反应管中加入 400?l PBS,混匀,流式细胞仪(FACS)分析,激发光波长用 488nm, 用一波长为 515nm 的通带滤器检测 FITC 荧光,另一波长大于 560nm 的滤器检测 PI。

4 MTT 测定:
取对数生长期的三组细胞用 0.25%Trypsin-EDTA 消化成单细胞悬液接种于 96 孔培养板,104 细 胞/孔,每孔加入 200?l 含 10%FBS 的高糖 DMEM 液,分别培养 0,12,24,36,48,72h,每组设 3 个复孔。在每个时间点加入 5mg/ml 的 MTT 液(20?l/孔),继续培养 4h,培养条件同上。吸 出孔内培养液后,加入 DMSO 液(150?l/孔) ,将培养板置于微孔板扳荡器上振荡 10min,使结 晶物充分溶解,酶标仪检测各孔 A570 值,绘制连续 5d 的细胞生长曲线。实验重复 3 次,结

果用 x±s 表示。 5 Hoechst33258 和 PI 染色:
Hoechst 33342 可以穿透细胞膜,染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI 不能穿透细 胞膜,对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞,其细胞膜的完 整性丧失,PI 可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后,使用荧光显微镜观察,正常细胞为弱 红色荧光+弱蓝色荧光,凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光,坏死细胞为强红色荧光+强蓝 色荧光。三组细胞接种于 6 孔板中,72h 取出玻片,用 1×PBS 洗一次。加入细胞染色缓冲液。 加入 5?l Hoechst 染色液。加入 5?l PI 染色液。混匀,4℃孵育 30min。PBS 洗涤一次。避光 干燥后在荧光显微镜下检测红色和蓝色荧光。

6 免疫组化检测:
将盖玻片加入6孔板中, 3组细胞分别铺板到6孔板中培养72h。1×PBS洗涤1次, 10%中性福 尔马林4℃固定过夜。次日,吸去固定液,取出玻片,晾干备用。30%H2O2 1份+甲醇50份混合, 室温浸泡30min,以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次。后续步骤参考说明书。

7 Western Blot 检测蛋白的表达:按说明书方法进行操作,提取细胞总蛋白进行 Western Blot 检测: SDS-PAGE 分离胶浓度为 12%,积层胶浓度为 5%,上样量为 15 μ g.L-1 ;SDS 电泳:恒流,每块板 20~40mA,电泳时间约 2 h;转膜:恒流,每张膜 42mA,时间: 3.5 h。 8 RT-PCR :按 TRizol 试剂盒( Invitrogen 公司)说明书操作提取不同组细胞总

RNA,取 1μ g RNA 模按 RT 试剂盒(Takara 公司)说明书反转录得到 cDNA。引物序 列:Slug(414bp): R:5'- CGTCACGACGGGTCAGAT-3'

,F:5’- ATCTGACCCGTCGTGACG -3’ 反应条件:50℃ 30 分钟, 94℃ 2 分钟, 94℃ 30 秒, 55℃ 30 秒,72℃ 1 分钟, 72℃延伸 7 分钟,28 循环。以上引物由赛百盛公司合成。取 5μ L 反应产物在含 EB 的 1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用 SYNGENE 型凝胶成像系统照像,以目的基因条带 和内参 G3PDH 条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量。 试验重复 3 次, 数据以 x ±s 表示。 结果 1 Slug-siRNA 抑制 Slug 基因和蛋白表达: Slug 检测发现, CaPan-2/pSlug-siRNA 细胞内 Slug 蛋白和 Slug-mRNA 表达已被显著抑制,而 CaPan-2/pNeg-siRNA 细胞 内 Slug 蛋白和 Slug-mRNA 表达无明显变化, 提示 Slug-siRNA 抑制了细胞内 Slug 的表达。 2 MTT 检测 : PaCan-2/pSlug-siRNA 和 PaCan-2/pNeg-siRNA 两组细胞生长能

力差异无统计学意义(P>0.05)。而实验组细胞的生长能力较低,细胞增殖明显滞后于前两组细 胞,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 Annexin V-FITC/PI 检测
FCM 显示转染 72h 后,PaCan-2/pSlug-siRNA 和 PaCan-2/pNeg-siRNA 细胞的凋亡 率均较低,差异无统计学意义(P>0.05)。Slug-siRNA 组细胞的凋亡率明显增高,与其他两 组组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

5 Hoechst33258 和 PI 双染色检测细胞凋亡:
荧光显微镜下,对照组和 CaPan-2/pNeg-siRNA 组细胞主要表现为弱红色荧光+弱 蓝色荧光,两种荧光在强度和比例上无明显差别。CaPan-2/pSlug-siRNA 组细胞主要为蓝 色容光,说明细胞的凋亡现象明显。

讨论 PUMA 是 2001 年发现的 bcl-2 家族 BH-3 亚家族中的成员, 是 p53 介导的下游 促凋亡基因,PUMA 活化后,导致下游的 bax 活化,细胞色素 C 释放和 caspase 反 应,最终导致细胞凋亡[3-5]。

Slug 是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,最初发现它与细胞的生存活力 有关[6],后来发现与促癌转移有关[7-8]。最近研究发现[1-2,9-10],Slug 是 PUMA 的强烈 抑制剂,Slug 通过抑制 PUMA 表达而对细胞凋亡起阻碍作用,而抑制 Slug 表达后 可解除 Slug 对 PUMA 表达的抑制,发挥了 PUMA 的促凋亡作应。 本研究利用 RNA 干扰技术探讨了 Slug 沉默后对胰腺癌 CaPan-2 细胞凋亡和增 殖的影响。实验发现 Slug-siRNA 转染沉默 Slug 后,细胞内 Slug 的蛋白和基因 表达几乎完全被抑制,同时伴随着细胞增殖能力下降,细胞凋亡率的明显提高, 说明 Slug 沉默有效地抑制体外胰腺癌细胞生长。转染了阴性对照质粒的细胞与 正常细胞相比 Slug 蛋白的抑制及体内外增殖和凋亡方面均无明显差异,说明该 质粒可以安全有效地应用。 本研究初步证明了利用 RNA 干扰技术针对 Slug 靶点能抑制胰腺癌细胞的体 外生长,为胰腺癌的基因治疗提供了一个新的切入点。 参考文献
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