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靶向Bcl


肿瘤防治研究 2 0 1 1 年第 3 8 卷第 5 期
: / . i s s n . 1 0 0 0 D O I 1 0. 3 9 7 1 8 5 7 8. 2 0 1 1. 0 5. 0 0 7 - j

·5 0 9·

靶向 B c l x i RNA 在前列腺癌细胞增 - L 基因 s 殖和凋亡中的作用
王政

华 , 牟 平, 刘晓梅 , 朱志图
E f f e c t o f s i R N A T a r e t e d a a i n s t B c l x n C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d A o t o s i s o f P r o s t a t e           -             g g p p Lo C a n c e r C e l l s  
, , , WANG Z h e n h u a MU P i n L I U  X i a o e i Z HU Z h i t u   -   -m   - g g , D e a r t m e n t o T u m o r T h e F i r s t A i l i a t e d  H o s i t a l, L i a o n i n M e d i c a l U n i v e r s i t J i n z h o u1 2 1 0 0 1,         p f  f f p g  y,

C h i n a C o r r e s o n d i n A u t h o r: ZHU  Z h i t u, E- m a i l: h e r o i h e a r t 6 3. c o m - @1 p g 
: A b s t r a c t O b e c t i v e o i n v e s t i a t e t h e e f f e c t o f s i R NA t a r e t e d a a i n s t B c l x n c e l l r o l i f e r a t i o n a n d  T                 -       g g g p j Lo r o s t a t e l a s m i d a o t o s i s o f P C 3 c a n c e r c e l l s .M e t h o d s s i R NA e x r e s s i o n v e c t o r a a i n s t B c l x a s     -        A             - p p p p p g Lw a n d t r a n s f e c t e d i n t o P C 3 c e l l s . T h e c h a n e s o f B c l x NA a n d r o t e i n e x r e s s i o n w e r e d e c o n s t r u c t e d         -         -           - g p p L mR t e c t e d b s e m i R T-P C R a n d W e s t e r n b l o t r e s e c t i v e l . C e l l w a s d e t e c t e d b MT T u a n t i t i v e r o l i f e r a t i o n   -                   y q p y p y     a o t o s i s w a s e v a l u a t e d b f l o w c t o m e t r . R e s u l t s h e s e u e n c e s e c i f i c s i R NA e f f e c t i v e l a s s a . C e l l            T   -     p p y y y q p y y   s u r e s s e d B c l x x r e s s i n a t b o t h mR NA a n d l e v e l s . B c l x x r e s s i o n s i n i f i c a n t l i n h i b i t e d r o t e i n   -           -   p p p g p g y p     Le Le ( ( r o l i f e r a t i o n P<0. 0 0 1) a n d i n d u c e d a o t o s i s o f P C 3 c e l l s P <0. 0 0 1) r e s e c t i v e l . C o n c l u s i o n  t h e           -   p p p p y s i R NA t a r e t e d a a i n s t B c l x o u l d e f f e c t i v e l s u r e s s P C 3 c e l l r o l i f e r a t i o n a n d s i n i f i c a n t l i n d u c e       -     -         g g y p p p g y     Lc P C 3 c e l l a o t o s i s . -     p p : ; NA ; ; ; w o r d s B c l x i n t e r f e r e n c e P r o s t a t e c a n c e r P r o l i f e r a t i o n A o t o s i s K e -     p p y   L R 摘 要: 目的   研究 B c l x NA 干 扰 对 前 列 腺 癌 P C 3细胞株体外增殖能力和凋亡的影 - - L 基因特异性 R 响 。 方法   构建靶向 B 表达载 体 , 转染 P 采用半定量 R c l x NA( s i R NA) C 3细胞后, T-P C R - - L 的小干扰 R 和W 采用噻唑兰 ( 法检测细胞 e s t e r n b l o t法检测转染前后 B c l x NA 及蛋白表达水平的改变 ; MT T)   - L mR 生长增殖情况 ; TUN E L 试剂盒测定细胞的凋亡 情 况 。 结 果   靶 向 B c l x i R NA 可 以 - L 的序列特异性的s 。 转染靶 向 B 有效地抑制 P C 3 细胞 B c l x c l x i R NA 表 达 质 粒 可 以 显 著 抑 制 P C 3细 - - - - L 基因的表达 L 的s ) , 。 结 论  B 胞的增殖 ( 诱导细胞凋亡 ( P<0. 0 0 1 P<0. 0 0 1) c l x NA 干 扰 可 以 显 著 抑 制 - L 基因特异性 R 前列腺癌 P C 3 细胞的体外增殖并诱导细胞凋亡 。 - ; NA 干扰 ; 关键词 : 前列腺癌 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 B c l x - L R ( ) 中图分类号 : R 7 3 7. 2 5   文献标识码 : A   文章编号 : 1 0 0 0 8 5 7 8 2 0 1 1 0 5 0 5 0 9 0 3 - - -

0  引言 B c l x c l 2 家族 中 一 个 重 要 的 凋 亡 抑 制 基 - - L 是B 因, 它在多种恶性 肿 瘤 中 高 表 达 , 与 肿 瘤 的 发 生、 发
1 3] - ; 展及预后密切相关 [ 它的高表达与某些恶性肿瘤

合成 的 B c l x NA ( s m a l l i n t e r f e r i n -   g L 小 干 扰 R 转染前列腺癌细胞 P 观察其在 R NA, s i R NA) C 3, - 前列腺癌细胞增殖和凋亡中的作用 。 1  材料和方法 1. 1  材料 人前列腺癌 P C 3 细 胞 购 于 Am e r i c a n T e -   y p ,M ,VA; C u l t u r e C o l l e c t i o n a n a s s a s R PM I 1 6 4 0培   、 养液 、 胎牛 血 清 ( 胰蛋白酶购自 G F B S) i b c o 公 司; L i o f e c t A  m i n e l u s 试剂购自I n v i t r o e n 公 司;     p g p ; 试剂盒 购 于 公 司 反 P C R T a K a R a A-ML V 转录试 剂盒 购 自 P r o m e a公 司; B c l x a c t i n抗体购 - - g L 和β 自C e l l S i n a l l i n E C L 化学发光检测试剂盒   g g 公 司; 购自 安 玛 西 亚 公 司 ; TUN E L 细胞凋亡检测试剂盒 购自上海 凯 基 生 物 技 术 有 限 公 司 , z D FMK 和 -VA - S T S 购自 S i m a 公司 。 g

肝 癌、 大 肠 癌 和 乳 腺 癌 细 胞 的 侵 袭、 如鳞状细胞癌 、 转移具有重要的 关 系
[ 2 6] -

。体 外 试 验 中 发 现, B c l x - L

基因表达水平增高 或 降 低 后 , 癌细胞侵袭性也相应
7 9] - 。 由此提示 , 地增强或者减弱 [ B c l x - L 基因在某些

癌细 胞 侵 袭 中 发 挥 着 重 要 的 作 用 。 本 研 究 采 用 , ) 技 术, 以化学 R NA 干扰 ( R NA i n t e r f e r e n c e R NA i  
收稿日期 : 修回日期 : 2 0 1 0 0 7 1 5; 2 0 1 0 1 1 2 6 - - - - 作者单位 : 辽宁医学院附属第一医院 1 2 1 0 0 1 辽宁锦州 , 肿瘤科 : 通信作者 : 朱志图 , E-m a i l h e r o i h e a r t 6 3. c o m @1 , 作者 简 介 : 王政华( 女, 硕 士, 主 治 医 师, 主要从 1 9 7 7 -) 事肿瘤病理的研究

·5 1 0· 1. 2  方法 具有雄激 1. 2. 1  细胞培 养   前 列 腺 细 胞 系 P C 3, - 素依赖特征 , 培养在改 良 的 F 含1 1 2 培 养 液 中, 0% - 热灭活胎牛血清 , 3 7℃ 、 5%C O 2 孵箱中 。 1. 2. 2 s i R N A 的构建 四对s i R N A 靶向人 B c l x - L ( _ ) 序列号为 和一个随机对照 m R N A NM 1 3 8 5 7 8 s i R - , 设计 所有 N A 序列 。 根据序列特异于 B c l x s i R N A - L , 。 的s i R N A由D h a r m a c o m 公司合成 ( L a f a e t t e C O) y 1. 2. 3 s i R NA 体外转染  s i R NA 转染实验采用脂 质体 L i o f e c t A  m i n e l u s 介 导 。 在 4℃ 条 件 下 ,     p p 每孔含1 s i R NA 预 先 包 埋 在 6 孔 培 养 板 中 , 0 0 / , 的 细 胞 接 种 于 孔 培 养 m o l 0. 5 m l s i R NA P C 3 6 - p
5 /孔 , 板中 , 细胞浓度为 1×1 0 7 2 h 后细胞裂解 。  

肿瘤防治研究 2 0 1 1 年第 3 8 卷第 5 期 采用 L s i R N A 进入 P C 3 细胞 , i o f e c t A  m i n e P l u s转 -     p 染P C 3 细胞后 。 3 号显示 9 9 % 基因沉默 B c l x - - L 蛋白 。 因此我们挑选 3 号 s 表达 , 见图 1 i R N A 作为最有效 的s 其几乎完全抑制 B i R N A 进行后 续 试 验 , c l x - L 蛋 白表达 及 其 m R N A 含 量。 而 阴 性 对 照 s i R N A 既没 有降低蛋白表达也没有影响 m R N A 水平 。

图 1  W e s t e r n 印迹法检测 B c l -x L 蛋白表达水平 F i u r e 1 B c l x r e s s i o n s i n t h e c a n c e r r o s t a t e   -x         g p p Le c e l l s P C 3 d e t e c t e d b W e s t e r n b l o t   -       y 

1. 2. 4 R T- P C R 和实时 P C R  总 R NA 以 细 胞 中 , 、 抽提 用 R T- P C R 和实时 P C R 分 析。 人 B c l x - L 和K B c l 2、 M c l 1和 B AX 根 据 Z h a n o m n r o - - g等 [ 1 1] 等 的 论 文 设 计, 针对 B 的 正 义 链 为 c l x S 5 ′ - - ,反 义 G C T T T GAA C AG GATA C T T T T G T G G 3 ′ -
[ 1 0]

2. 2 B c l x s i R NA 特 异 抑 制 P C 3细胞中的 B c l - - - L- x NA L mR 用R 观察 B T- P C R 方 法, c l x s i R NA 是 否 对 - L- B c l 2 家 族 其 他 成 员 有 影 响。 结 果 显 示: B c l x s i R - - - L- , 特异抑 制 的 表 达 而 不 影 响 家 族 其 N A B c l x B c l 2 - - L 、 、 、 ) 。 他成员 ( 的表达 , 见图 2 B c l x S B c l 2 M c l 1 B a x - - -

链 为 5 ′ G C AAT C TAG T C T C C T T T C T G G -AAG - 。P , , 3 . C R 条件 : 9 4℃3 0 s 5 5℃3 0 s 7 2℃ 1 m i n。 循       环3 0次。 用 1. 2. 5  蛋 白 印 迹 分 析   细 胞 用 缓 冲 液 E 裂 解 ( P B S 配液 , 1%N P 4 0, 0. 5% 脱 氧 化 酶 , 0. 1% 十 二 烷 - , 基硫化 物 , 蛋白浓度用 B 5 0 n m 氟 化 钠) i o r a d D c   -   蛋白试剂 盒 测 定 。 等 量 蛋 白 ( 每孔3 用1 0μ 2% g) , , S D S P AG E电泳分离 电转至纤维素膜上 在含有 - 室温封闭1 0. 1%T w e e n 2 0 的 5% 脱 脂 奶 粉 中 , h。 - 然后用鼠抗人 B 用含0 c l x h, . 1% - L 抗体室温培养1 最后采用羊抗鼠辣根过氧 T w e e n 2 0的 P B S 洗 膜, - 。 按照试验盒说明书操作 ) 化酶法测定 ( 1. 2. 6  细胞增殖分析   为测定 B c l x s i R NA 对细 - L- 胞增殖的影响 , 细胞分别被 B 和阴性对 c l x s i R NA - L- 照B 接种在9 c l x s i R NA- S C R 转 染, 6 孔 培 养 板。 - L- 4 细胞密度为每孔 1×1 培养液换成无 0 个, 1 2 h 后,   血清培养液 。 在特 定 时 间 里 , 用细胞计数试验盒测 定细胞活性 。 或 1. 2. 7  TUN E L 实验 细胞用 B c l x s i R NA( - L- 转染 4 重新接种8个平 B c l x s i R NA- S C R) 8 h 后, -   L-
4 皿中 。 细 胞 浓 度 为 每 皿 3×1 个, 0 7 2 h后进行  

图 2 RT-P C R 检测 P C 3 细胞中其他 B c l 2 家族成员的表达 - - F i u r e 2 L e v e l s o f o t h e r B c l 2 f a m i l m e m b e r s i n r o s t a t e         -       g y p   c e l l s P C 3 d e t e c t e d b RT-P C R c a n c e r     -     y  

2. 3 B c l x C 3 细胞生长 - - L 下调抑制 P 转染 B c l x s i R NA 或 对 照 S C R s i R NA 进 入 - - L- 观 察 其 对 细 胞 增 殖 的 影 响。对 P C 3 细胞 , 4 8 h 后, -   比B c l x s i R NA 和 B c l x s i R NA- S C R 的生长曲 - - L- L- 发现 B 线, c l x s i R NA 显 著 抑 制 细 胞 生 长 ( t - L- s i R NA = ) , 见图 3。 5. 8 2, P<0. 0 0 1; t . 0 3, P>0. 0 5 S C R =1

TUN E L 实 验 。 TUN E L 阳性细胞用 M e t a M o o h y 软件计数 。 1. 2. 8  统计学方法   实验数据应用 S P S S1 2 . 0 软件 。 处理 , 采用t检验法 , 为差异有统计学意义 P< 0 . 0 5 2  结果 2. 1 s i R NA 的选择 首先挑 选 有 效 的 s 通过转染4个 B i R N A, c l x - - L
图 3  细胞生长曲线 F i u r e 3 T h e c e l l r o w t h c u r v e o f t h e c e l l s t r a n s f e c t e d                 g g w i t h B c l s i RNA o r B c l s i RNA- S C R   -x     -x L- L-

肿瘤防治研究 2 0 1 1 年第 3 8 卷第 5 期 2. 4 B c l x s i R NA 在体外增加 P C 3 细胞凋亡 - - L- 用B c l x s i R NA 处理 P C 3 细胞显示有高比例 - - L- 。 的 TUN E L阳性细胞( t 6 8, P<0. 0 0 1) N o s i R NA =4.   对比 B c l x s i R NA- S C R 和 B c l x i R NA 加 z - - - L- L s , ( , 共孵 育 时 得 到 相 似 结 果 VA D- FMK t 9 7 S C R =4. ) , 见图 4。 可 P<0 . 0 0 1; t 2 1, P<0. 0 0 1 z D -VA -FMK =5. 见在 P C 3细胞中 B c l x a s a s e 3途径 - - - p L 下调通过 C 诱导凋亡 。

·5 1 1· 实了 B c l x - L 通过抑制细胞凋亡参与前列腺癌的发 生、 发展 , 而且提示 了 靶 向 B c l x i R NA 在 前 列 - L 的s 腺癌的治疗中可能具有实际的价值 。
参考文献 :
[ ] , 1 r e c i c k i T, F r a c z e k M, K o z l a k J e t a l . B c l x L e x r e s r o t e i n  K         -     - p p ] s i o n i n l a r n e a l s u a m o u s c e l l c a r c i n o m a[ J . C l i n O t o l a r n             - y g q y , ( ) : o l 2 0 0 4, 2 9 1 5 5 5 8. - g [ ] 2 h a o WL, D a n e s h o u ME,M o u n i e r N, e t a l . P r o n o s t i c s i  Z         - p y g g   n i f i c a n c e o f b c l x L e n e e x r e s s i o n a n d a o t o t i c c e l l c o u n t s i n     -               g p p p [ ] , ( ) : f o l l i c u l a r l m h o m a J . B l o o d 2 0 0 4, 1 0 3 2 6 9 5 6 9 7.   - y p [ ] , 3 a t a n a b e J K u s h i h a t a F, H o n d a K, e t a l . P r o n o s t i c s i n i f i c a n c e  W           g g ] , o f B c l x L i n h u m a n h e a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a[ J . S u r e r 2 0 0 4,   -         p g y ( ) : 1 3 5 6 6 0 4 6 1 2. - [ ] 4 u r a E, S e n z a k i H,Y a m a m o t o D, e t a l .P r o n o s t i c s i n i f i  O           - g g g / c a n c e o f B c l 2, B c l x L S, B a x a n d B a k e x r e s s i o n s i n c o l o r e c     - -           - p [ ] , ( ) : t a l c a r c i n o m a s J . O n c o l R e 1 9 9 9, 6 2 3 6 5 3 6 9.     - p [ ] 5 a n H S, P a r k YM, Hw a n T S. D i f f e r e n t i a l e x r e s s i o n o f B c l  H           - g p   2, B c l x L a n d 5 3 i n c o l o r e c t a l c a n c e r[ J] . J G a s t r o e n t e r o l -             p , ( ) : H e a t o l 2 0 0 6, 2 1 7 1 1 0 8 1 1 1 4.   -   p [ ] 6 h a n Y L, P a n L Q, Wu Y, e t a l . S i n i f i c a n c e o f B c l x L i n h u  Z         -     - g g g     , m a n c o l o n c a r c i n o m a[ J] .W o r l d J G a s t r o e n t e r o l 2 0 0 8, 1 4         ( ) : 1 9 3 0 6 9 3 0 7 3.   -   [ ] 7 s a ? a L, F e r n ? n d e z Y, R u b i o N, e t a l . O v e r e x r e s s i o n o f B c l  E             - p p x L i n h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s e n h a n c e s o r a n s e l e c t i v e               - g [ ] , l m h n o d e m e t a s t a s i s J . B r e a s t C a n c e r R e s T r e a t 2 0 0 4, 8 7           y p ( ) : 1 3 3 4 4. - [ ] 8 e i l e r M, B ? h r O, H o h l w e U, e t a l . B c l x L: t i m e d e e n d e n t  W       - - g p   d i s s o c i a t i o n b e t w e e n m o d u l a t i o n o f a o t o s i s a n d i n v a s i v e n e s s             p p [ ] , h u m a n m a l i n a n t c e l l s J . C e l l D e a t h D i f f e r 2 0 0 6, 1 3 i n l i o m a             g g ( ) : 7 1 1 5 6 1 1 6 9.   -   [ ] ¨ ¨ 9 e r n ? n d e z Y, E s a n a L,M a n a s S, e t a l . B c l x L m e r o m o t e s  F         -     - p p t a s t a s i s o f b r e a s t c a n c e r c e l l s b i n d u c t i o n o f c t o k i n e s r e s i s t                 - y y   [ ] , ( ) : a n c e J . C e l l D e a t h D i f f e r 2 0 0 0, 7 4 3 5 0 3 5 9.     - [ ]Z 1 0 h a n L, Z h a o H, S u n A, e t a l . E a r l d o w n r e u l a t i o n o f B c l x L       -     - g y g     d u r i n m e a k a r o c t i c d i f f e r e n t i a t i o n o f t h r o m b o o i e t i n e x r e s s i o n         - g g y y p p  
+ i n d u c e d C D 3 4 b o n e m a r r o w c e l l s i n e s s e n t i a l t h r o m b o c t h e m i a             y

图 4 TUN E L 实验检测 B c l s i RNA 对前列腺癌 -x L- P C 3 细胞凋亡的影响 - F i u r e 4 E f f e c t o f B c l s i RNA o n a o t o s i s o f       -x       g p p L- r o s t a t e c a n c e r c e l l s P C 3 d e t e c t e d b TUN E L       -     p y  

3  讨   论 B c l x c l 2家 族 中 一 个 重 要 的 凋 亡 抑 制 - - L 作为 B 基因 , 在多种恶性 肿 瘤 中 高 表 达 , 与 肿 瘤 的 发 生、 发 、 展及预后密切 相 关 。B c l x - L 基因高表达与肝癌 大 转移具有重要 肠癌和乳腺癌等恶 性 肿 瘤 细 胞 侵 袭 、 的关系 。 体外试 验 研 究 发 现 , B c l x - L 基因表达水平 增高或降低后 , 癌细 胞 侵 袭 性 也 相 应 地 增 强 或 者 减 弱 。 由此提示 , B c l x - L 基因在某些癌细胞侵袭中发 挥着重要 的 作 用 。 本 实 验 对 B c l x - L 与前列腺癌关 , 系的研究表明 , B c l x - L 在前列腺癌中存在着高表达 并通过抑 制 细 胞 凋 亡 参 与 前 列 腺 癌 的 发 生 、 发 展。 这些研究提 示 B c l x - L 有望成为前列腺癌基因治疗 中的有效靶点 。 R NA i是一种由 双 链 R NA 介 导 的 序 列 特 异 性 的转录后基因沉默过程 。 自发现以来 , s i R NA 已广 泛应用于基 因 功 能 、 肿 瘤、 病毒性疾病等的治疗研 究, 用R NA i沉默 s u r v i v i n和 V E G F 基因 表 达 对 前
[3 1 4] - 。本研究 列腺癌细胞系 P C 3的研究已见报道 1 -

[ ] , , ( ) : J .H a e m a t o l o i c a 2 0 0 4 8 9 1 0 1 1 9 9 1 2 0 6 . - g [ ]K , 1 1 o m u r o I Y a s u d a T, I w a m o t o A, e t a l . C a t a l a s e a c r i t l a s               - p y i c a l r o l e i n t h e C S F i n d e e n d e n t s u r v i v a l o f h u m a n m a c r o h a         -         - p p [ ] e s v i a r e u l a t i o n o f t h e e x r e s s i o n o f B C L 2 f a m i l J . J B i o l               -     g g p y ( ) : 2 0 0 5, 2 8 0 5 0 4 1 1 3 7 4 1 1 4 5. C h e m, - [ ]O 1 2 h a S, N o m u r a A, T a k a d a H, e t a l . D o m i n a n t e x r e s s i o n o f             g p i n t e r l e u k i n 1 0 a n d t r a n s f o r m i n r o w t h f a c t o r b e t a e n e s i n -       -     g g g   T c e l l s o f c h r o n i c a c t i v e E s t e i n B a r r v i r u s i n f e c t i o n a c t i v a t e d   -         -     p [ ] , ( ) : J . J M e d V i r o l 2 0 0 4, 7 4 3 4 4 9 4 5 8.     - [ ] 沈建军 , 刘家云 , 苏 明 权, 等. 用 RNA 1 3 i沉 默 s u r v i v i n基因表达 ] 中 国 肿 瘤 生 物 治 疗 杂 志, 对前列腺癌细胞系 P C 3的影响[ J . ( ) : 2 0 0 6, 1 3 1 3 7 4 1. - [ ] 李然伟 , 王珂 , 杨泽成 , 等. 1 4 s i RNA 抑 制 人 前 列 腺 癌 P C 3细胞 - ] 吉林大学学报( 医 学 版) 株V E G F的 表 达 及 细 胞 增 殖 [ J . ) : 2 0 0 8, 3 4( 4 5 8 5 5 8 9. -

构建了靶向 B c l x i R NA 表 达 质 粒 并 转 染 - L 基因的s 前列腺癌细胞 P 通过半定量 R C 3, T- P C R及 W e s t - - 所构建的靶向 B e r n b l o t 检 测 结 果 表 明, c l x   - L 的 可有效地抑制 s i R NA 表达载体具有高 度 的 特 异 性 , 细胞中 基 因 及 蛋 白 的 表 达; 抑 P C 3 B c l x mR NA - - L 制P C 3 细胞 B c l x - - L 基因的表达 可 以 显 著 抑 制 细 胞 的增殖并诱导明显的细胞凋亡 。 本研究结果不但证

[ 编辑 : 黄园玲 ; 校对 : 杨   卉]


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