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化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测


中国组织工程研究与临床康复

第 12 卷 第 16 期

2008–04–15 出版
April 15, 2008 Vol.12, No.16

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research

基础医学

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化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测**★
郝荣增1,2,刘慧姝2,马保华1

Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cells
Hao Rong-zeng1,2, Liu Hui-shu2, Ma Bao-hua1 Abstract
AIM: Researching the pertinent literature in China Journal Full-text Database (CJFD) published between 2005 and 2008 indicated that the inhibitory effect of small interference RNA (siRNA) was determined by the transfection efficiency in RNA interference. At present, there are few reports about detection of the transfection efficiency for human WISH cells with chemosynthesis siRNA. In this study, we use the flow cytometer detected the transfection efficiency and the effect on apoptosis of WISH cells after chemosynthesis siRNA transfected human WISH cells. METHODS: The experiment was performed at the Experimental Medical Research Center of Guangzhou Medical College from March to December 2007. ①WISH cells were bought from Shanghai Life Science Academy of Chinese Academy Of Sciences. ② WISH cell line was transfected with CY3-Negative siRNA (0, 5, 10, 20, 30 nmol/L). Twenty-four hours later, transfection efficiencies of different protocols were evaluated by fluorescent microscopy and flow cytometer. Apoptosis of WISH cells was detected with Annexin V-EGFP kit after 24-hours 20 nmol/L CY3-Negative-siRNA transfection. RESULTS: Red fluorescence was discovered under the fluorescence microscope with 5, 10, 20, 30 nmol/L CY3-Negative siRNA transfected WISH cells, and no signals were discovered in control group. The transfection efficiency of 20, 30 nmol/L CY3-Negative siRNA was remarkably higher than 5, 10 nmol/L CY3-Negative siRNA transfection groups (P < 0.05). There was no significant difference in transfection efficiency between 20 nmol/L and 30 nmol/L siRNA groups (P > 0.05). The apoptosis of WISH cells was detected after 24-hours transfection with 20 nmol/L Negative siRNA. The apoptotic rates were 1.96% and 2.36% in the transfection and control groups, respectively. There was no significant difference in apoptosis of WISH cells between transfection group and control group. CONCLUSION:①The chemosynthesis siRNA can transfect human amnion-derive WISH cells successfully, and there is no effect on the apoptosis of WISH cells after transfection. ②Better transfection efficiency can be obtained in 20 nmol/L siRNA transfected human WISH cells. Hao RZ, Liu HS, Ma BH.Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3115-3118(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3115(ps).pdf]
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College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, 2 China; Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China Hao Rong-zeng ★ , Studying for master's degree, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China rongzenghao@ hotmail.com Correspondence to: Ma Bao-hua, Associate professor, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30471828*; the Scientific Research Priming Foundation for Returned Persons of Ministry of Education, No. Jiaowaisiliu[2005] 383* Received:2008-01-02 Accepted:2008-02-13

摘要
目的: 检索中国期刊全文数据库 2005/2008 相关文献显示, RNA 干扰研究中, 转染效率的高低直接决定 siRNA 的表达效果, 目前关于应用小分子干扰 RNA 对人羊膜 WISH 细胞转染效率的检测研究少见。 实验应用化学合成 siRNA 转染人羊膜 WISH 细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并初步检测转染对细胞凋亡的影响。 方法:实验于 2007-03/12 在广州医学院试验医学研究中心完成。①实验材料:实验中应用的人羊膜 WISH 细胞株购于中国 科学院上海生命科学研究所。 ②实验方法: 应用 0, 10, 5, 20, nmol/L 化学合成的 CY3-Negative siRNA 转染人羊膜 WISH 30 细胞,转染后 24 h 应用荧光显微镜和流式细胞仪定性、定量评估其转染效率;20 nmol/L CY3-Negative-siRNA 转染细胞 24 h 后,应用 Annexin V-EGFP 试剂盒检测细胞早期凋亡情况。 结果:荧光显微镜显示,5,10,20,30 nmol/L CY3- Negative siRNA 转染细胞内均可见红色荧光,对照组无荧光信号。20 , 30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于 5,10 nmol/L 组(P < 0.05);20 nmol/L 和 30 nmol/L siRNA 组转染效 率差异不显著(P > 0.05)。检测 20 nmol/L Negative siRNA 转染细胞 24 h 后的细胞早期凋亡情况,转染组与对照组细胞早 期凋亡率分别为 1.96 %和 2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率差异不显著。 结论:①化学合成的 siRNA 可以成功转染人羊膜 WISH 细胞,转染后对细胞的早期凋亡率无影响。②20 nmol/L 的 siRNA 即可获得理想的转染效果。 关键词:WISH 细胞;siRNA;转染;羊膜细胞 郝荣增,刘慧姝,马保华.化学合成 siRNA 转染人羊膜的 WISH 细胞的效率检测[J].中国组织工程研究与临床康复,2008, 12(16):3115-3118 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3115(ps).pdf]

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课 题 背 景 : 国家自然科学基金项目 (30471828)“水通道蛋白基因(AQPs) 在人胎盘胎膜的表达研究” 和教育部留 学回国人员科研启动基金({2005}383)资 助项目。目前课题组应用 RT-PCR 、 Western blot 和免疫组织化学方法已完成 水通道蛋白基因在正常胎盘和胎膜组织 以及羊水过多和过少的表达研究。 应用要点: 检索中国期刊全文数据库 2005-2008 年相关文献显示,目前关于 应用化学合成 siRNA 转染人羊膜上皮 细胞方法及效率的检测报道鲜见。实验 应用化学合成的 siRNA 转染人羊膜上 皮细胞 WISH 株,检测其转染效率,并 对化学合成的 siRNA 转染细胞后对细 胞凋亡的影响进行了检测。 相 关 链 接 :RNA 干扰技术是研 究基因表达及蛋白功能的有效方 法, 近年来已成为基因功能研究的 热点。RNA 干扰实验中,外源性 导入 siRNA 可抑制同源性基因的 表达, 其效果最终取决于进入细胞 内部 siRNA 的多少。因此有必要 选择合适的转染方法和条件。

ISSN 1673-8225

CN 21-1539/R

CODEN: ZLKHAH

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郝荣增,等.化学合成 siRNA 转染人羊膜的 WISH 细胞的效率检测

西北农林科技大 学动物医学院, 陕 西 省 杨 凌 712100;2 广州医 学院第三附属医 院, 广州市妇产科 研究所, 广东省广 州市 510150 郝荣增★,男, 1981 年生,河南 省林州市人,汉 族, 西北农林科技 大学在读硕士, 主 要从事动物胚胎 工程研究。 rongzenghao@ hotmail.com 通讯作者:马保 华,副教授,西北 农林科技大学动 物医学院, 陕西省 杨凌 712100

将细胞稀释至浓度为1×108 L-1,制成细胞悬 0 引言 人羊膜WISH细胞来源于正常足月妊娠的人 羊膜上皮细胞 [1] ,对研究人羊膜上皮细胞的生 物学特性有重要作用。转染是将具生物功能的 核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维 持其生物功能。其中,核酸包括DNA(质粒和 线性双链DNA) ,反义寡核苷酸及RNAi(RNA interference)[2]。转染技术已广泛应用于基因组 功能研究(基因表达调控、基因功能、信号转 导和药物筛选研究)和基因治疗研究。RNA干 扰研究中,转染效率的高低直接决定siRNA 的 表达效果。 检索中国期刊全文数据库2005-2008 年相关文献显示,目前关于应用小分子干扰 RAN 对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研 究鲜见。 1 材料和方法 设计:开发性实验。 单位:西北农林科技大学动物医学院,广 州医学院第三附属医院,广州市妇产科研究 所。 材料: 实验于2007-03/ 12在广州医学院试验 医学研究中心完成。人羊膜WISH细胞株购于中 国科学院上海生命科学研究所;CY3-Negative siRNA 和Negative siRNA 购于美国Ambion公 司;主要试剂与仪器: RPMI-1640 培养基及 0.25% Typsin- EDTA(Hyclone公司, USA)、 胎牛 血清(杭州四季青公司) 、转染试剂siPORTTM NeoFXTM (Ambion, USA)Annexin V FITC/PI 凋 、 亡检测试剂盒(南京凯基公司)、流式细胞仪(BD FACSCalibur, USA);荧光显微镜(Leica DMIRB E microsystems, Germany) 。 设计、 实施、 评估者: 设计为第一、 二作者, 实施为全部作者,评估为第二、三作者。 方法: 细胞的准备:人羊膜WISH细胞用含体积分 数为0.10胎牛血清的RPMI1640 培养基,37 ℃, 体积分数为0.05的CO2培养箱培养。倒置显微镜 下观察细胞铺满瓶底时传代培养;转染前24 h, 将培养基更换为无抗生素的培养基,转染前1 h, 弃去培养瓶中的培养液,加0.25 %胰酶,37 ℃ 温箱消化约5 min。加5 mL培养基终止消化,将 培 养 瓶 中 的 细 胞 悬 液 移 入 15 mL 离 心 管 中 , 1 000 r/min离心5 min,弃上清,加适量培养液, 2.1 荧光显微镜观察siRNA转染细胞 CY3 为红色荧光标记,应用CY3-Negative siRNA转 染人羊膜WISH 细胞后,可根据细胞内有红色 荧光的细胞数量,来判断转染阳性细胞的数 量。通过荧光显微镜的初步观察,5,10,20, 30 nmol/L的CY3-Negative siRNA转染组细胞 内均可见红色荧光,对照组无荧光信号,表明 化学合成siRNA可以成功转染人羊膜WISH细 胞。见图1。
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液。放入37 ℃,体积分数为0.05的CO2细胞培 养箱孵育。进行siRNA转染。 siRNA转染及转染效率检测:siPORTTM NeoFXTM 按5 μL/孔加入到95 μL/孔的无血 清无抗生素的1640培养基中, 室温孵育10 min; 用无血清和抗生素的1640培养基配制终浓度 分别为5,10,20,30 nmol/L的CY3-Negative siRNA。将二者混合,室温孵育10~20 min,然 后按200 μL/孔将混合液等量加入6 孔培养板, 取2 300 μL/孔细胞悬液覆盖于混合物上, 轻轻 混匀,同时设对照组,37 ℃、体积分数为0.05 的CO2 培养箱孵育;转染后4~6 h,吸去培养 液,用4 ℃ PBS洗细胞2次,进行荧光显微镜 观 察 ; 转 染 后 24 h 将 细 胞 用 0.25 % Typsin-EDTA 消 化 对 照 组 和 实 验 组 细 胞 , 用 4 ℃ PBS洗细胞两次。 流式细胞仪计数发红色 荧光的细胞数,计算转染效率。 siRAN转染及细胞凋亡检测:按上述方法 配制转染试剂siPORTTM、 NeoFXTM及20 nmol/L 的Negative siRNA。二者混合,室温孵育10~ 15 min后进行转染,设空白对照组;37 ℃、体 积分数为0.05的CO2 培养箱孵育;转染后24 h 将细胞用0.25 % 不含EDTA的胰酶消化,用 4 ℃ PBS洗细胞2次,离心收集细胞,加入 500 μL的Binding Buffer悬浮细胞,然后加入 5 μ L AnnexinV-EGFP 混 匀 后 加 入 5 μ L Propidium Iodide,混匀,避光反应5~15 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 主要观察指标:①siRNA转染细胞荧光观 察结果。 ②化学合成siRNA对WISH细胞的转染 效率。③siRNA转染后细胞凋亡情况。 统计学方法:由第一、二作者采用SPSS 13.0软件完成统计处理,效率分析比较用χ2分 析,P < 0.05为统计学有显著差异。 2 结果

国家自然科学基 金资助(304718 28)“水通道蛋白 基因(AQPs)在 人胎盘胎膜的表 达研究”*; 教育部 留学回国人员科 研启动基金 (教外 司 留 [2005]383 号)*
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:1673-8225 (2008)16-03115-04 收稿日期:2008-01-02 修回日期:2008-02-13 (08-50-1-9/GW·Q)

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郝荣增,等.化学合成 siRNA 转染人羊膜的 WISH 细胞的效率检测

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5 nmol/L

10 nmol/L 20 nmol/L a: Ordinary light

30 nmol/L

a: Control group

b:

Transfection group

Figure 3 Apoptosis of WISH cells by flow cytometry 图 3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况
5 nmol/L 10 nmol/L 20 nmol/L b: Fluorescence 30 nmol/L

Figure 1 图1

Transfection of different concentrations of small interference RNA(siRNA) with a fluorescence microscope (×200) 荧光显微镜观察不同浓度 siRNA 转染结果 (×200)

3

讨论 正常的羊水量对维持胎儿的生长和发育有重要作

2.2

流式细胞仪检测转染效率 0, 10, 30 nmol/L 5, 20,

用。羊水过多或羊水过少是常见的妊娠并发症, 其围产 儿病率和死亡率显著升高[3]。 人羊膜WISH细胞来源于正 常足月妊娠的人羊膜上皮细胞[1],WISH 细胞是研究羊 水膜内转运吸收的分子机制的实验模型,也是体外研究 羊膜上皮细胞的生物特性及其功能调节的有效实验模 型。目前采用人羊膜WISH细胞作为实验模型进行羊水 平衡调节的膜内途径及其他基因功能的研究已有报 道[4-10]。 1998年华盛顿卡耐基研究院AndrewFire和马萨诸塞 大学癌症研究中心的CraigMello发现双链RNA(double strand RNA, dsRNA)可以抑制线虫同源基因的表达使基 因沉默,且沉默可遗传给F1代,遂将此现象命名为RNA干 扰(RNA interference, RNAi) [11]。 RNAi是由与靶基因序列 同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性的转录 后基因沉默机制。其通过降解具有同源序列靶基因的 mRNA,达到阻止基因表达的作用[12-13]。RNAi 现多被 用于诱导培养的哺乳动物细胞蛋白敲低作用[12,14],在基 因功能研究和疾病的基因治疗中有巨大的潜在应用价 值。 RAN干扰实验中, 外源性导入siRNA 可抑制同源性

的CY3-Negative siRNA 对人羊膜WISH细胞的转染效率 分别为0,7.7%,39.35%,87.27%和95.78%;20 nmol/L 和30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于 5 nmol/L 和 10 nmol/L 组 ( P < 0.05 ) 20 nmol/L 和 ; 30 nmol/L siRNA组转染效率无显著差异 (P > 0.05), 20 nmol/L和30 nmol/L的siRNA均可获得理想的转染效 果,见图2。

a: 0 nmol/L (Control)

b: 5 nmol/L

c: 10 nmol/L

d: 20 nmol/L

e: 30 nmol/L

Figure 2

Effect of different concentrations of small interference RNA (siRNA) on transfection efficiencies of cells by flow cytometry 图 2 流式细胞仪检测不同浓度 siRNA 对细胞的转染效率

基因的表达,其效果最终取决于进入细胞内部的siRNA 的多少,即转染效率。因此有必要选择合适的转染方法 和条件。Splinter、Nicchia和Laforenza等[15-17]分别应用化 学合成的siRNA转染特定的细胞,并成功抑制了AQPs 在细胞的表达;Yue等[18]应用脂质体2000转染siRNA成功 的沉默了K562细胞C-Myc基因的表达。 目前常用的siRNAs制备方法有5种:化学合成、体外 转录、酶切长片段dsRNAs、siRNA表达载体或病毒载体在 细胞中表达siRNAs、PCR 制备的siRNA 表达框在细胞中 表达。其中化学合成法具有方法简单、需要时间短、获得 的siRNA纯度高、可以进行标记以及适于短期体外实验研 究等优点。使用化学合成的siRNA可以高效特异性地抑制 外源性和内源性基因的表达[19]。 而要达到最大基因沉默效 果和最低细胞毒性, 转染效率的优化至关重要。 Zhang等[20] 研究提高化学合成的siRNA转染胎盘成纤维细胞的效率,

2.3

流式细胞仪检测细胞凋亡 由于20 nmol/L siRNA

进行转染人羊膜WISH细胞即可获得理想的转染效率, 所以检测20 nmol/L的Negative siRNA转染细胞24 h后的 细胞早期凋亡情况,转染组和对照组细胞早期凋亡率分 别为1.96 %和2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率无显著 差异,因此转染对细胞早期凋亡的影响不明显;见图3。 2.4 不良反应 干预措施可能造成少量细胞死亡。 2.5 可能影响结果的因素分析 实验中细胞的密度和 传代的次数、siRNA使用浓度、转染试剂的选择、转染 复合物的孵育时间、培养液中血清和抗生素含量等因素 均可能影响实验结果。
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改进方法后转染效率比传统转染方法提高2~9倍。本实 验结果显示, nmol/L和30 nmol/L的siRNA转染效率分 20 别为87.27 %和95.78 %,显著高于5 nmol/L和 10 nmol/L siRNA 的 转 染 效 率 , 提 示 20 nmol/L 和 30 nmol/L 的 siRNA 均 可 获 得 理 想 的 转 染 效 果 , 说 明 转 染 效 率 随 siRNA浓度增加而升高。同时控制细胞接种密度也是决 定细胞是否能够高效转染的关键因素,本实验细胞融合 度控制在60 %~70 %范围内。 为了达到稳定的转染效率,转染方案的规范化和恒 定化是至关重要的。细胞的类型、接种密度和传代的次 数、siRNA使用浓度、转染试剂的选择、转染复合物的 孵育时间、培养液中血清和抗生素的含量等因素也是影 响转染效率的重要因素。在相关体外实验中,使严格控 制转染条件规范和恒定成为可能。本实验结果提示在规 范的操作及恒定的条件下,选用20~30 nmol/L的化学合 成siRNA转染人羊膜WISH细胞可取得理想的转染效率, 为化学合成siRNA 转染人羊膜上皮细胞及应用RAN干 扰技术进行体外研究提供了实验依据。 本实验发现20 nmol/L 化学合成siRNA 转染人羊 膜WISH细胞即可达到理想的转染效率,而任何转染试 剂对细胞都有一定的毒性作用。因此,本实验检测 20 nmol/L siRNA 转染24 h 后,对人羊膜WISH细胞早 期凋亡的影响,结果发现转染后细胞早期凋亡率较对照 组有升高但并无显著性差异;提示该转染试剂对细胞毒 性较低,适合人羊膜WISH细胞的转染。 本实验结果说明人羊膜WISH细胞适合应用化学合 成siRNA转染;转染试剂siPORTTM NeoFXTM适用于化学 合成的siRNA转染人羊膜WISH细胞;化学合成siRNA转 染人羊膜WISH细胞的适宜浓度为20~30 nmol/L。 4 参考文献
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