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siRNA转染方案


siRNA 转染方案 -向六孔板的每个孔种植2 x 10^5个细胞,每孔加入 2ml不含抗生素的培养基 注意: 根据孔或 注意: 这个方案是针对六孔板中的一个孔, 皿的大小决定细胞和试剂的量。 -在含有CO2的37° C 孵箱中培养细胞至60-80%融合。 这大概需要18—24小时。 注意: 注意:健康和不完全融合的细胞对于成功转染试验是 必要的。建议转染前一天要确保细胞存活。 -准备以下溶液: 溶液A: 每次转染,稀释2-8 ?l siRNA duplex(例 如 0.25-1μg 或20-80pmol siRNA)至100 ?l siRNA 转染基sc-36868 溶液B: 每次转染,稀释2-8 ?l siRNA转染试剂 sc-29528至100 ?l siRNA转染基sc-36868。6 ?l siRNA 转染试剂可达高峰反应 注意: 注意:不要向siRNA转染基sc-36868内添加血清和抗 生素 注意: 注意:最佳siRNA转染使用量对于不同目标蛋白是不 同的,需通过实验来决定 注意: 注意:如果需要低浓度siRNA,可用siRNA稀释缓冲 液sc-29527稀释

注意: 尽管siRNA 转染试剂sc-29528对很多细胞系都 注意: 是高效的,但可能不适用于所有细胞 -直接将溶液A加入溶液B,然后用吸管上下轻柔吹打, 室温下孵育15-45分钟 -用2ml siRNA转染基 sc-36868清洗细胞一次,吸出 转染基立即进入下一步骤 -每次转染,向溶液A和溶液B混合液中加入0.8ml转染 基。轻柔混合后用混合液覆盖冲洗过的细胞 -将细胞放在含CO2的37℃孵箱孵育5-7小时 注意: 注意:有些细胞可能需要长时转染。然而长时血清饥 饿可能会导致细胞分离或凋亡。 注意: 注意:结合了荧光素的对照siRNA只能在含CO2的37℃ 孵箱孵育5-7小时,孵育结束后利用荧光显微镜检测 -加入1ml两倍血清浓度和抗生素浓度的正常培养基 (2x正常培养基),不要移除转染混合液。如果有细胞 毒性,移除转染混合液,用1x正常培养基替代 -将这些细胞再孵育18-24小时 -吸出培养基,用新鲜1x正常培养基取代 -加入新鲜培养基24-72小时后利用合适的方案检测细 胞 注意: 在siRNA试验中应该设立对照。 应用对照siRNA: 注意: sc-37007, sc-44230, sc-44231, sc-44232, sc-44233,

sc-44234, sc-44235, sc-44236, sc-44237 or sc-44238或结合荧光素的对照siRNA:sc-36869, sc-44239, sc-44240 or sc-44241。以上每种都包含一 个扰频序列, 不会导致任何已知的mRNA特异性降解。 注意: 注意:对于免疫印迹分析,按如下方法准备细胞裂解 液:用PBS冲洗一次细胞。在300?l 1x 电泳样品缓冲 液(sc-24945: 电泳样本缓冲液, 2X)通过吸管上下吹 打或轻轻震荡六孔板方法来裂解细胞。 如果需要的话, 可以冰上超声裂解细胞。 注意: 注意:RT-PCR分析提取RNA可以利用P. Chomczynski and N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.)描述的方法或者商品化RNA提取试剂 盒


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