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动物细胞培养和核移植技术(上课用)[1]


动物细胞培养和核移植技术
第一课时

提问:
? 植物细胞工程常用的技术手段有哪些?

植物组织培养, 植物体细胞杂交

动物细胞工程常用的技术手段:
动物细胞培养、 动物细胞核移植、 动物细胞融合、 单克隆抗体 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的 基础。

一、动物细胞培养
1 、动物细胞培养的概念 从动物机体中取出相关组织,将它们分 散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,

让这些细胞生长和增殖。

2.动物细 胞培养的 过程

动物组织块 (幼龄动物的器官、组织或胚胎)

胰蛋白酶或胶原蛋白酶 处理分散成单个细胞
加入培养液

细胞悬液

适宜条件 原代培养 用胰蛋白酶等处理贴壁细胞,使细 胞从瓶壁脱落 传代培养

原代 培养

传代 培养 细胞贴 满瓶壁

细胞 悬浮液

50代 细胞

⑴原代培养:
将动物组织经胰蛋白酶等处理后的初次培养。

⑵传代培养:
对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理,然后再分

瓶继续培养。

动物细胞培养技术流程
动 单 细 物 个 加培养液 胞 剪碎 组 胰蛋白酶 细 悬 织 胞 液
或胶原蛋 白酶

贴 壁 生 长

分 接触抑制 瓶 培 养

原代培养 10 代 细 细胞核型 胞 不变
少数

50 代 少数癌变 不 细 失去接触 死 胞 抑制现象 细 胞

传代培养

⑶接触抑制 当贴壁细胞生长到表面相 互接触时,细胞就会停止分裂 增殖—细胞出现接触抑制。 哪些细胞失去了接触抑制? 传代培养时,少数超过50 代的细胞,由于遗传物质发生 改变,可无限增殖,并失去了 接触抑制——肿瘤细胞。

动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官 胰蛋白酶 遗传物质未 改变

细胞悬浮液 10代细胞 细胞株 50代细胞 细胞系

遗传物质 改变

无限传代(不死 性)

P46讨 论
多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中, 根据你所学的内环境的知识,思考以下问题: 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质?
充足营养(糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量 元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。)

2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件?
适宜温度、PH和气体环境;无菌无毒环境

4、动物细胞培养条件:
1、无菌、无毒的环境 (添加一定量的抗生素,定期更换培养液) 2、营养 (葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。) 3、温度和PH 保证细胞顺利的 36.5+(-)0.5度, 7.2-7.4 生长增殖 4、气体环境: O2和CO2(95%空气和5% CO2 )
维持培养液的PH

5、动物细胞培养应用
? 大规模培养生产生物制品(病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体) ? 作为基因工程中的受体细胞 ? 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质, 判断某种物质的毒性 ? 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依 据

思考: 1、动物细胞培养液的主要成分是什么?较植物组培培养基有何独
特之处?
主要成分:葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。 独特之处有:1、液体培养基 2、成分中有动物血清等 2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞 培养材料? 因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛,分裂能力强 3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞? 成块组织不利培养,分散了做成细胞悬浮液利于培养 4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个 体? 不能,动物细胞培养只能使细胞数目增多,不能发育成新的 动物个体

比较项目 原理 培养基性质 培养基特有成分 培养结果 培养目的

植物组织培养 细胞的全能性
固体培养基 蔗糖、植物激素 植物体或组织 快速繁殖、培育 无病毒植株等

动物细胞培养

细胞增殖
液体培养基 葡萄糖、动物血清 细胞株、细胞系 获得细胞 或细胞分泌蛋白

动物细胞培养和核移植技术
第二课时

二.动物细胞核移植技术和克隆动物
1.动物细胞核移植概念:
将动物的一个细胞核,移入一个已经去掉细 胞核的卵母细胞中,使其重组并发育成为一个新 的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体(克 隆动物)。 细胞分化程度低, 胚胎细胞核移植: 分 恢复全能性容易; 类 细胞分化程度高, 体细胞核移植: (难度高) 恢复全能性不容易

A母绵羊

B母绵羊 乳腺细胞

多 莉 羊 的 培 育 过 程

卵母细胞

细胞质 细胞核移植

细胞核 融合后的卵母细胞 卵裂 早期胚胎 胚胎移植

C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊

2、体细胞核移植的过程:
请看教材P48图2-21 思考: 1.核移植的受体细胞是什么?处在什么时期?用此细 胞作为受体细胞有什么好处? MⅡ中期卵母细胞

卵母细胞体积大,便于操作;含有营养物质丰富, 提供早期胚胎发育所需的营养;含有激活细胞核体 现全能性的物质。
2.通过什么手段激活受体细胞,构建重组胚胎?

诱导方法:物理或化学方法激活受体细胞,完成 细胞分裂和发育进程。

卵母细胞采集、培养

2.体细胞核移植过程 (体细胞克隆动物)
显微 操作

MⅡ中期卵母细胞

去核 去核卵母细胞

供体细胞注入 去核卵母细胞 体细胞培养

电激处理使供 体核进入受体 移植 代孕母牛 卵母细胞构建 重组胚胎

胚胎

克隆牛

原理:动物细胞核具有全能性
供体牛

3.体细胞核移植技术的应用前景: 1.加速家畜遗传改良的 进程 2.保护濒危物种 3. 生产医用蛋白质及 组织器官的移植 4.了解胚胎发育和衰老 过程;追踪研究疾病的 发展过程和治疗疾病

4、体细胞核移植技术存在的问题 (1)成功率非常低

P173

(2)克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问 题 成功率低,绝大多数克隆动物存在健康问

题并表现出遗传和生理缺陷:如体型过大,异
常肥胖,发育困难,脏器缺陷,免疫失调等。

讨论:(教材P49)
1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之 前,为什么必须先去掉受体卵母细胞的核?

为使核移植的胚胎或动物的遗 传物质全部来自有重要利用价值的动 物提供的体细胞,在供体细胞的细胞 核移至受体细胞之前,必须将受体细 胞的遗传物质去掉或将其破坏。

2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代 10代以内的细胞,想一想,这是为什么?
培养的动物细胞一般当传代至10~ 50代左右时,部分细胞核型可能会发生 变化,其细胞遗传物质可能会发生突变, 而10代以内的细胞一般能保持正常的二 倍体核型。因此,在体细胞核移植中, 为了保证供体细胞正常的遗传基础,通 常采用传代10代以内的细胞。

3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动 物,是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗? 为什么? 克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核,但 其核外还有少量的DNA,即线粒体中的DNA是来 自于受体卵母细胞。
此外,即便动物的遗传基础完全相同,但动物的一些 行为、习性的形成与所处环境有很大关系,核供体动 物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同, 其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同, 从这一角度看,克隆动物不会是核供体动物100%的复 制。

思考与探究(教材P50)
1.动物细胞培养取材时,一般是取胚胎组织或幼龄动 物的组织或器官,请解释原因。 细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系,细胞 的增殖能力与供体的年龄有关,幼龄动物细胞增殖能 力强,有丝分裂旺盛,老龄动物则相反。所以,一般 来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于 培养。同样,组织细胞的分化程度越低,则增殖能力 越强,所以更容易培养。 拓展---动物组织或细胞培养的难易程度 幼体组织或细胞 > 老龄组织或细胞

分化程度低的组织或细胞 > 分化程度高的组织或细胞 肿瘤组织或细胞 > 正常组织或细胞

思考与探究(教材P50)
2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗?为什么?

动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高 度分化的动物细胞发育潜能变窄,失去了 发育成完整个体的能力,所以,动物细胞 也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱 分化过程了。要想使培养的动物细胞定向 分化,通常采用定向诱导动物干细胞,使 其分化成所需要的组织或器官。

3.1997年,美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达 (Lucinda)的奶牛,年产奶量为30.8 t,创造了世界奶牛产 奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛,年平均产 奶量一般为十几吨,而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3~4 t。 (1)能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达 吗?请说明理由。

可以。卢辛达的产奶量很高,有高产奶的遗传基础, 利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上 全部来自该奶牛,其克隆牛具有高产的遗传基础, 如果精心培育和饲养,有可能在世界范围内推广, 克隆牛再与高产的公牛自然繁殖,可得到很多高产 的后代,从而加快奶牛改良进程。 该克隆牛不能无限制地推广,其数量不宜过多,尤 其是在小范围内不能无限的繁殖,以避免奶牛群出 现近亲繁殖而引起种质衰退。

(2)如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你,你将如何 对它进行克隆?

从卢辛达耳朵(也可用别的组织、器官,耳朵在活体 上容易取)上剪取一小块组织,在体外培养获得该组 织(如软骨组织)的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢, 抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞 的核,再将耳细胞注入卵母细胞,用电刺激方法使卵 母细胞与体细胞融合,这时供体核就进入了受体卵母 细胞,再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的 卵母细胞,使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚 胎在体外短时间培养后,挑选正常卵裂的胚胎植入经 同期发情处理的受体母牛体内。

4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么 问题?请你查阅资料,了解这方面的前沿动态。

研究方面:克隆动物基因组重新编程的机制 尚不清楚,克隆技术效率低,克隆动物畸形 率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些 问题尚在研究中。 应用上:生产克隆动物费用昂贵,距大规模 应用还有一定距离。

1.动物细胞培养技术是如何发展起来的? 知识拓展
1907年,哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基,培 养蛙胚神经组织存活数周,并观察到神经细胞突起的生长过程,由 此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法,奠定了动物组织体外培养 的基础。之后,又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养,提高了传 代效率并减少了污染。1923年,卡雷尔(Carrel)设计了卡氏瓶培 养法,扩大了组织生存空间。 1951年, 厄尔 (Earle) 发明了 体外培养动物细胞的人工合成培养基。1951年,波米拉(Pomerat) 设计了灌流小室,使细胞生活在不断更新的培养液中,便于作显微 摄影和细胞代谢的研究。1957年,格拉夫(Graff)用灌流技术进 一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年,杜尔贝科(Dulbecco) 等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法,获得了单层 细胞培养。单层培养法的出现,对组织培养的发展起了很大的推动 作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。20世纪60年代 后,动物细胞大规模培养技术开始起步,并逐步发展。20世纪80年 代后,随着基因工程和其他细胞工程技术的发展,细胞培养技术已 成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础,在现代生物技 术中发挥着重要的作用。

2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养?用酶消化的

知识拓展

是什么物质? 细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养,也可以用细胞 群(团)、组织块培养,经传代培养后,最终都为细胞培 养。 分散成单个细胞、细胞群(团)后容易培养,细胞所需的 营养容易供应,其代谢废物容易排出;而用大块组织培养 时,内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难,因 此,这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时, 分散成单个细胞培养,可使得在细胞水平操作的其他技术 得以实现。 用酶消化的是细胞间基质,细胞间基质主要成分有胶原蛋 白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白 酶可使其消化,从而使细胞相互分离。

细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有MⅡ期卵母细胞 3.体细胞核移植技术为什么要选择MⅡ期的卵母细 知识拓展 和受精卵(合子)。早期核移植技术中常用受精卵,后来 胞做受体细胞? 基本上用MⅡ期卵母细胞取代了受精卵,主要因为两者的细 胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于MⅡ期卵母 细胞的胞质中,而在原核形成时这些因子已被降解或用光, 因此,原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。 成熟促进因子(MPF)是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响 因子,MPF的活性在卵母细胞减数分裂的MI期和MⅡ期达到 最高,受精或激活后,MPF迅速灭活,因此,MⅡ期卵母细 胞中MPF活性高,而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可 影响供体核染色质的状态和复制。MⅡ期卵母细胞细胞核、 细胞质已成熟,而 MI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟, 也有人认为用去核合子做受体时,可能由于合子去核时一 其细胞质不能支持胚胎的全程发育,因此,尽管 MI期卵母 些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了,而使去 细胞 MPF活性也高,但不能用作受体卵母细胞。 核受精卵缺乏发育能力。因此,目前广泛采用 MⅡ期卵母细 胞做受体。


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