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chapter 1 Why gene cloning and DNA analysis are important_图文

基因工程 Genetic engineering
College of life science Fujian Normal University 福建师范大学生命科学学院 Bihong SHI, 施碧红 Email: shibh@fjnu.edu.cn
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教材及主要参考书目
教材:《基因克隆和DNA分析》Gene Cloning and DNA Analysis (第五版),T.A.Browm, 魏群等译;高等教育出版社, 2007.12 参考书目: 1.《基因工程原理》(上,下)第二版 吴乃虎 科学出版社 2001 2.《简明基因工程原理》,第二版,贺淹才编著,科学出版社, 2005 3.《基因操作原理》 Principles of Gene Manipulation(第六版), (英)S.Primrose,R.Twyman,B.Old; 瞿礼嘉,顾红雅译; 高等教 育出版社,2003 4. 《基因VII》 Gene VII, Benjamin Lewin

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Contents
Part 1: The Basic Principle of Gene Cloning and DNA Analysis 1 Why gene cloning and DNA analysis are important 2 Vehicles for gene cloning : Plasmids and bacteriophages 3 Purification of DNA from living cells 4 Manipulation of purified DNA 5 Introduction of DNA into living cells 6 Cloning vectors for E. coli 7 Cloning vectors for eukaryotes 8 How to obtain a clone of a specific gene 9 The polymerase Chain Reaction
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Contents
Part 2: The Applications of Gene Cloning and DNA Analysis in Research 10 Studying gene location and structure 11 Studying gene expression and function 12 Studying Genomes Part 3: The Applications of Gene Cloning and DNA Analysis in Biotechnology 13 Production of protein from cloned genes 14 Gene cloning and DNA analysis in medicine 15 Gene cloning and DNA analysis in agriculture 16 Gene cloning and DNA analysis in forensic science
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Chapter1 Why gene cloning
and DNA analysis are important

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本章主要内容
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 遗传学的早期发展 基因工程的诞生 什么是基因克隆 基因克隆的意义 基因组和后基因组研究的发展

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1 The early development of genetics

Figure 1.1 A brief history of genetics
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1.1 DNA is the genetic material

Figure 1.2 The transforming principle is DNA.
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1.1. 基因是DNA
1944年,美国细菌学家 O.T.Avery等证明了肺炎球 菌转化因子是DNA, 首次证 实遗传的物质基础是DNA, 基因位于DNA分子, DNA 分子是遗传信息的载体。 打破了蛋白质是细胞遗传 物质的信条。

图1 转化过程的核心是DNA

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1.1 DNA is the genetic material

Figure 1.3 The genetic material of phage T2 is DNA
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1952年A.D.Hershey 和M.Cha-se用 35S和 32P分别标记T2噬菌 体的蛋白质和核酸, 感染大肠杆菌的实验 进一步证明了是遗传 物质。

T2 噬菌体的遗传物质被证明是DNA(捣碎实验) 11

1.2 DNA is a double helix

Figure 1.8 The two strands of DNA form a double helix.
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1.3 DNA replication is semicon-servative

Figure 1.9 Base pairing provides the mechanism for replicating DNA.

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1953 年美国生物学家Watson和英国生物物理学家Crick 建立了DNA 的双螺旋结构模型,并提出了DNA的复制机制。 这时,人们开始接受了基因是具有一定遗传效应的DNA片段。

图3 碱基配对是DNA复制原理的基础 图2 DNA的两条链形成双螺旋结构
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1.4 The genetic code is triplet

Figure 1.25 Frameshift mutations show that the genetic code is read in triplets from a fixed starting point.
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2. The advent of genetic engineering

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2.1.基因工程的诞生
分子生物学理论和技术发展的积累使得基因工程技术 的出现成为必然。 理论方面: 理论方面 (1)20世纪40年代,确定了生物遗传的物质基础是DNA, 不是蛋白质。 明确了遗传物质的基础问题 (2) 20世纪50年代,DNA双螺旋结构模型 半保留复制机理 解决了核酸复制、遗传信息传递的问题。 (3) 20世纪50年代-60年代,遗传信息传递中心法则, 操纵子学说, 成功破译遗传密码, 阐明了遗传信息的流向和表达问题
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系列关键性技术的问世为基因工程的产生 与发展奠定了切实可行的技术基础
1. DNA的切割和连接 A.核酸限制性内切酶 1968年在细菌中发现一种酶,能裂解入侵的外来DNA, 以阻止入侵者的繁殖--核酸限制性内切酶(限制酶、内 切酶) B. DNA连接酶(1967年) 能参与DNA裂口的修复,在一定条件下还能连接DNA分 子的自由末端的酶
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2. 基因克隆载体(vector)的发现 虽然DNA体外重组是基因工程的核心技术,但由于DNA片段无 自我复制能力,所以需要一种载体。 3. 大分子的分离制备、合成方法和检测手段的建立 如,分子杂交技术,异源双链电子显微镜分析、琼脂糖电泳等 4. 大肠杆菌转化体系的建立 大肠杆菌经氯化钙处理后,能吸收lamda噬菌体的DNA, 也能摄取质粒DNA,称为转化受体。 至此,理论和技术上都具备了条件,基因工程的兴起成为必然。

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2.2.概念
Gene manipulation/gene cloning: : 基因操作、 基因操作、基因克隆 基因工程:在分子水平上,采取工程建设方式 照预先设计的蓝图 按

借助于实验室技术将某种 使

生物的基因或基因组转移到另一生物中去 后者定向获得新遗传性状的一门技术。

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2.3.基因工程的发展
1971年 史密斯(Smith H. O.)等人从细菌中分离出的一 1971 种限制性酶,酶切病毒DNA分子,标志着DNA重组时代 的开始。 1972年 伯格(Berg P.)等用限制性酶分别酶切猿猴病毒 1972 和λ噬菌体DNA DNA,将两种DNA分子用连接酶连接起来,得 DNA 到新的DNA分子。 1973年 科恩(Cohen S.)等进一 1973 步将酶切DNA分子与质粒 DNA连接起来,并将重组 质粒转入E. cloi细胞中。

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1982年,美国食品卫生和医药管理局批准,用基因工程在 细菌中生产人的胰岛素投放市场。 1985年,转基因植物获得成功。 1986年,Mullis发明了PCR技术,专利转让达3亿美元。 1994年,延熟保鲜的转基因番茄商品生产。 1997年,Wilmut研究小组报道用胎儿细胞为核供体,获得了表 达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆羊“波莉” “ ” 2002年,完成水稻基因组测序 2003年,中、美、日、德、法、英6国科学家宣布人类基因组 6 序列图绘制成功。

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2.4. 基因工程的应用

目前,基因工程研究发展迅速,已取得一系列 重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农 业、畜牧业、医学、法学等领域,为人类创造 了巨大的财富。

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(1).基因工程工业 最早应用基因工 程生产人的蛋白质 的方法是在细菌中 表达人的胰岛素 (1982)。 (1982) 基因工程生产人 的胰岛素的方法如 图所示。

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现已在细菌中生产几百种 药品,例如表皮生长因子、人 生长激素因子、干扰素、乙型 肝炎工程疫苗等。 目前,酵母菌、植物悬浮 细胞、植株和动物培养细胞均 成功地应用于表达外源蛋白。

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基因工程创造的财富:

胰岛素 1000 磅牛胰 10 克胰岛素; 200 升发酵液 10 克胰岛素; 干扰素 1200 升人血 2-3 万美元/ 病人; 1 升发酵液 200-300 美元/ 病人

人的生长激素释放因子 50万头羊脑 ~ 9升细菌培养液所得的激素
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(2)、植物基因工程
植物基因转化是指将外源基因转移到植 物细胞内、并整合到植物基因组中 稳定遗传和表达的过程。 农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多。 利用抗草甘磷(glyphosate) E. coli中分 离克隆的EPSP合成酶基因,已培育 出高抗除草剂转基因植物。

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全球转基因作物种植面积达13亿亩 全球转基因作物种植面积达 亿亩

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2001年种植面积>100 >100万公顷的转基因作物: 2001 >100 大豆(3330万hm2, 63%, 占全世界转基因作物的

均为抗除草剂大豆)、玉米(980万hm2 ,

占19% )、棉花(680万hm2 ,占13% )、油菜 (270万hm2 ,占5% ); 其它还有水稻、 小麦、 花生、 向日葵、

亚麻、 甘蓝、马铃薯等,番茄、烟草、南瓜和木瓜 等50多种转基因作物已培育成功。 主要分布在美国(3570万hm2)、阿根廷(1180 万hm2)、加拿大(320万hm2)和中国(150万hm2) 等国。
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2001年我国的转基因农作物和林木已达22 22 种,其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟 草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进 行了田间试验,转基因棉花已经大规模商 品化生产。

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(3)、转基因动物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转 基因动物技术已用于牛、羊,使得从牛/羊奶中 可以生产蛋白质药物,称为“乳腺反应器”工 程。这是生物制药全新的生产模式,国际上已 经成为生物技术领域发展的重要方向。 美国开发了可生产人凝血酶原III III的转基因羊; III 英国PPL制药公司也培育出可制造人抗胰蛋白 酶和人类生长因子Ⅸ的转基因羊; 荷兰制药公司制备了可大量生产人乳铁蛋白和 促红细胞生成素(EPO EPO)的转基因牛。 EPO
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生物高科技技术所带来的直接经济效益相当可观, 并且每年大幅度快速增长。根据预测: 2005年,仅是美国的乳腺生物反应器生产的药物 年销售额就将达到近400亿美元; 2010年,所有基因工程药物中利用生物反应器生 产的份额将达到所有生物制药总量的95%,超过 1000亿美元。

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(4)、工程菌在环境工程中应用:

美国GE 公司构造成功具有巨大烃类分解 能力的工程菌,并获专利,用于清除石油 污染。

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3.what is gene cloning
Basic steps: ①.Construction of a recombinant DNA molecules; ②.Transport into the host cell; ③.Multiplication of recombinant DNA ④.Division of host cell; ⑤.Numerous cell divisions resulting in a clone。

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4. Why gene cloning is so important
有可能创造新的生物类型,为细胞分化、生长发育、肿瘤发 生等有关高等生物的基础研究提供有效实验手段。 为农业、工业和医药卫生等领域的变革开辟新途径。如,固 氮基因的转移、新品种(高产、优质、多抗)的培育、清污 的微生物类型、诊断和治疗人类疾病(疫苗、抗体、激素、 酶、维生素等)。

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5. 基因组和后基因组研究的发展
5.1.基因组学的研究 基因组学(genomics):遗传学研究进入分子水平后发展起 (genomics): (genomics) 来的一个分支,主要研究生物体内基因组的分子特征。 研究对象: 从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。 研究目标: 认识基因组的结构、功能和进化; 阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系; 充分利用有效资源,预防和治疗人类疾病
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5.2.基因组计划(genome (genome project) (1)、基因组学的重要组成部 分 1).构建基因组的遗传图谱; 2).构建基因组的物理图谱; 3).测定基因组DNA的全部序 列; 4).绘制基因组的转录本图谱; 5).分析基因组的功能。

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1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的 序列; 1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对硷基序列; 80年代λ噬菌体DNA全部48,502硷基对的序列全部测出; 一些小的病毒,包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因组 的全序列也陆续被测定; 1996年底许多科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组 DNA的全序列长4x106硷基对。 测定一个生物基因组核酸的全序列对理解这一生物的生 命信息及其功能有极大的意义。

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(2)、人类基因组计划( HumanGenomicProject)
1990年10 1990 10月,美国启动被誉为“人体阿波罗计划”的 10 “人类基因组计划” ,投资30亿美元,计划历时15年 测定人类基因组的30 30亿个核苷酸对的排列次序 30 分辨率的人类基因组遗传图谱和物理图谱 信息学 解开生命的奥秘,疾病的预防 和治疗,提高健康水平。 2003年4 14 14日, 2003 4月14 全部实现HGP HGP的所有目标。 HGP
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构建高 发展生物

中国人类基因组计划
我国的HGP计划于1994年启动,由国家自然科学基金委、 国家高技术计划(863)和国家重点基础研究计划(973) 所共同资助的。 基因组多样性方面:如中国人群进化关系(走出非洲)。 疾病基因的研究:克隆了遗传性高频耳聋的致病基因, 定位了若干单基因疾病的染色体位点。 功能基因研究:已获得EST十多万条,克隆了1000条以上 新基因的全长cDNA。在白血病和某些实体肿瘤相关 基因的结构、功能研究方面,取得了一批具有国际 影响的成果。

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(3).模式生物基因组研究:
国际GP中,为人类的基因组研究提供重要的依据。 1996年,完成大肠杆菌基因组DNA的全序列测定 1996年,完成酵母菌基因组测序。 1998年12月,宣告完成线虫完整基因组序列的测定工作,这是第一次 绘出多细胞动物的基因组图谱。 2000年3月,已完成了果蝇的基因组测序 2001年12月14日,美、英等国科学家宣布绘制出拟南芥基因组的完 整 图谱。 2002年,完成水稻基因组测序

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5.3.后基因组学(post-genomics) (post(post

(1).概念 (1). 在完成基因组图谱构建以及全部序列测 定的基础上, 研究全基因组的基因功能、 基因之间相互关系和调控机制为主要内 容的学科。

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(2).面临的最重要问题 (2). 2003年4月14日,宣布人类基因组序列图绘制成 功。目前,虽然完成了99%人类基因的序列分 90%以上的人类基因尚不了解功能。 析,但90% 90% 自从1996 1996年酵母菌基因组全序列测定以来,全世 1996 界已有1000多个实验室、5000多名科学家从 1000 5000 事酵母菌后基因组学的研究,共发表论文7000 多篇,鉴定1060个新基因的功能,但仍然还有 约1600 1600个阅读框架(基因)的功能不清楚。 1600

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如何将人类和模式生物体基因序列资料转变为有用的知识, 如何对这些基因加以利用,使之能够造福于人类的健康。

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